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1、1钠泵抑制物噬菌体单链抗体库的构建作者：原卫清王颢吕卓人陈萍韩骅牛利国 【关键词】 钠泵抑制物 关键词: 钠泵抑制物;噬菌体展示技术;抗体 摘 要:目的 应用噬菌体展示技术构建钠泵抑制物单链抗体库 . 方法 用 OUA-OVA（ouabain-ovalbumin）免疫小鼠，取脾脏，分离淋巴细胞，提取 mRNA，逆转录成 cDNA 第一链，用简并引物经 PCR 分别扩增轻、重链抗体库，经重叠延伸 PCR 由 Linker 将轻、重链拼接成 ScFv（单链抗体） ，用 RS 引物以 ScFv 为模板进行第 2次 PCR，同时在 5及 3端分别加上 SfiI，NotI 酶切位点.经SfiI， Not
2、I 酶切后，在 T4 连接酶的作用下将 ScFv 与 pCANTAB5E噬菌粒连接，电转化进入 TG1 大肠杆菌，挑取 12 个单菌落提取质粒用 EcoR 和 Hind 进行酶切鉴定，后经 M13KO7 辅助噬菌体拯救，离心收集上清即为全套 ScFv 基因的噬菌体表面展示文库. 结果 以 OUA-OVA 免疫小鼠，检测血清中抗体效价可达（1 2106 ） ，用通用引物分别扩增出轻、重链片段的大小为 325bp 和340bp，将两者拼接得到约 720bp 大小的单链抗体库，以 81011 的转化效率转染 TG1 细胞，EcoR 和 Hind酶切后，12 个单菌落所提噬菌粒 DNA 中有 10 个
3、切出了约为 2.1kb 的目的条带，所构建的噬菌体抗体库库容量约为 1.2108 .经 M13KO7 超感染后，测2噬斑滴度为 91014 pfu L-1 . 结论 成功地构建了钠泵抑制物噬菌体单链抗体库. Keywords:ouabain;phage display;antibodies Abstract:AIM To construct a ouabain ScFv（single chain fragment variable）antibody library by phage display.METHODS Mice were immunized by OUA-OVA（ouabain-o
4、valbumin）.mRNA was isolated from the spleen lymphocyte and reversely transcripted.The heavy-chain and kappa light-chain variable region genes（VH and VL ）repertoirs of im-munoglobin were amplified individually and assembled into ScFv by a linker with overlap extension PCR.ScFv was reamplified with RS
5、 primer，meantime SfiI and NotI restric-tion sites were added to the ScFv different ends.ScFv was di-gested by SfiI and NotI，and cloned into the phagemid pCANTAB5E and introduced into E.coli TG1by electropo-ration.Phagemid-containing bacterial colonies were infected with M13KO7and the ScFv fusion pro
6、tein was displayed on the surface of recombinant phage.RESULTS Titer of rat serum was1.2106 after being immunized with OUA-OVA.The VH ，VL fragment was340bp 3and325bp，respectively.After assembly，the ScFv was about720bp.The library ca-pacity was1.2108 .Ten clones of twelve clones contained2.1kb fragme
7、nt after EcoRI and Hinddigestion.Trans-fection test indicated that the titer of the culture supernatant was about91014 pfu L-1 .CONCLUSION A phage display library of ouabain ScFv antibody has been constructed suc-cessfully. 0 引言 近几年来，抗体已较多地应用于基础研究与临床，但由于mAb 的鼠源性而大大限制了其在临床上应用，由此相继出现了基因工程抗体和噬菌体抗体库技术.我
8、们通过噬菌体展示技术制备钠泵抑制物（又称内源性哇巴因，endogenous ouabain，EO）单链抗体库，以期从中筛选到钠泵抑制物单链抗体. 1 材料和方法 1.1 材料 RNA 及 mRNA 提取试剂盒分别为美国 Gibco 公司及美国 Bio101 公司产品 .逆转录酶为 Pharmacia 公司产品.Taq DNA 聚合酶为美国 Promega 公司产品;dNTP 为 Clontech 公司产品.PCR 引物为 Pharmacia 公司产品，其中Heavy-chain 4primer1 和 2 分别为 VH 基因 5端和 3端引物，用来扩增鼠 Ig VH 基因;Light-chain
9、 primer mix 为 10 种 VL 基因引物的混合物，用来扩增鼠 Ig VL 基因;Linker primer mix:序列为（Gly4 Ser）3 ，该引物两端的各 24 个碱基分别与 VH 和 VL 基因的 3端和 5端相互补，从而可将 VH 和 VL 基因片段拼接成 ScFv 基因;RS primer mix 为带有 SfiI 位点的重链基因 5端引物和带有NotI 位点的轻链基因 3端引物的混合物，用来扩增 ScFv 基因片段同时引入克隆位点.噬菌粒载体 pCANTAB5E 为 Pharmacia 公司产品. 其中含有氨苄抗性基因（Ampr ） ，Plac 启动子及 M13 噬
10、菌体间隔区片段，用于克隆 ScFv 基因的 SfiI，NotI 克隆位点及 E tag序列和瑚珀终止码 TAG;辅助噬菌体 M13KO7 为 Pharmacia 公司产品，带有突变型基因，质粒复制起点和卡那霉素抗性基因（Kanr ） ，在其辅助下可使前者产生含单链噬菌粒基因组的噬菌体颗粒. 细菌菌株 TG1 为 Pharmacia 公司产品，用于 ScFv 噬菌体表面展示. 1.2 方法1-5 6wk 龄雌性 BALB/c 小鼠（本校实验动物中心提供）体质量 1720g，适应性饲养 1wk 后，以 50g OUA-OVA（ovalbumin ）免疫小鼠，每隔 4wk 免疫 1 次，共免疫 3
11、次，末次免疫后 3d，取免疫效果较好的小鼠立即处死，迅速取出脾脏，分离淋巴细胞，按 TRIzol 试剂说明书要求提取细胞总 RNA，用Bio101 试剂盒提取 mRNA.参照 Pharmacia 公司的逆转录系统产品5说明书，以 mRNA 为模板，在逆转录酶的催化下 371h 合成cDNA 第 1 条链.以逆转录合成的 cDNA 第 1 条链为模板，用通用引物进行全套 VH 和 VL 基因的扩增.纯化回收的 VH ，VL 基因片段与 Linker primer mix 以相同或接近等摩尔浓度混合进行重叠延伸 PCR 反应，从而将全套 VH ，VL 基因随机拼接成 ScFv 基因库.以 RS p
12、rimer 为引物将拼接的 ScFv 扩增，同时在 5及 3端分别加上 SfiI，NotI 酶切位点. 用 SfiI 和 NotI 消化 ScFv，将全套 ScFv基因片段与 pCANTAB5E 载体在 T4DNA 连接酶（57）U 作用下进行连接.同时作载体自连和阳性插入（control insert）对照. 用 Bio Rad 电转化仪将连接产物转化入 TG1 感受态细胞，37 摇床 1h 后，取 100L 涂于 SOBAG（含有 100mg L-1 氨苄青霉素和 20g L-1 葡萄糖的 SOB 培养基）琼脂板上， 30培养 24h.从生长良好的SOBAG 平皿上挑取 12 个单菌落提取
13、质粒用 EcoR 和 Hind进行酶切鉴定.取部分菌液加氨苄青霉素至终浓度为 100mg L-1 和葡萄糖至终浓度为 20g L-1 ，37 振 荡培养（250r min-1 ）1h. 至对数生长期后，加入 M13KO7 辅助噬菌体，37 振荡培养 1h.离心，弃上清后将沉淀细胞再悬浮于 2YTAK（含有 100mg L-1 氨苄青霉素和 50mg L-1 卡那霉素的 2YT 培养基）中，37振荡培养（250r min-1 ）过夜 .离心，收集上清即为含全套 ScFv 基因的噬菌体表面展示文库.将所得文库做 10-6 ，10-8 ，10-10 和 10-12 梯度稀释，进行噬斑培养实验，观察噬
14、斑生长情况以判断 ScFv 基因噬菌体表面展示文库的滴度. 62 结果 2.1 OUAOVA 的免疫效果 以 50g/次的 OUA-OVA 免疫BALB/c 小鼠， ELISA 法测血清中抗体的效价最高可达 1 2106 . 2.2 全套 VH ，VL 基因片段的扩增和鉴定 以逆转录合成的cDNA 第 1 条链为模板，加入针对鼠 Ig V 区基因不同家族的重链和k 轻链可变区引物进行 PCR，即得到了全套抗体 VH 和 VL 基因.电泳结果显示，扩增出的 VH 基因片段约为 350bp，VL 约为325bp，VH 略大于 VL （Fig1） ，与预期的片段大小相符. 图 1 略 2.3 全套
15、ScFv 基因的拼接和 PCR 扩增 将纯化回收后的 VH 和 VL 基因片段，经过定量，各取 VH 和 VL 50ng 与 Linker-Primer 混合.经 7 次重叠延伸反应，可将 VH ，VL 基因片段随机连接成 VH -Linker-VL （ScFv）. 以此为模板，再以 RS prime 进行第2 次扩增，在 VH 基因 5端加上 SfiI 位点，Jk 基因 3端加上NotI 位点.电泳结果表明，扩增产物约为 720bp（Fig2）. 2.4 全套 ScFv 基因的克隆和文库的构建 经 SfiI 和 NotI 消7化后，将纯化的 ScFv 基因克隆入 pCANTAB5E 载体中，
16、以全部连接产物电转化 TG1 细胞，转化效率最高可达 81011 g-1 ，然后在 SOBAG 选择性固相培养基上筛选转化的菌落.在载体自连对照和无连接产物转化菌的平皿上，均无单菌落生成;而在阳性插入对照和连接产物转化菌平皿上，均见大量单个菌落形成.随机挑选 12 个单菌落制备噬菌粒 DNA，以 EcoR 和 Hind双酶切鉴定，10 个单菌落所提噬菌粒 DNA 切出了约为 2.1kb 的条带（含有外源插段） ，与预测结果一致（Fig3） ，表明克隆较成功，所构建的噬菌体抗体库库容量约为 1.2108 ，由于经过 2 次 PCR 有重复克隆的存在，实际的库容量可能没有这么大.噬菌粒文库经过 M13KO7 超感染后，产生的重组噬菌粒可释放于细菌培养上清中，经噬斑计数，滴度为91014 pfu L-1 . 图 2 图 3 略 3 讨论 内源性钠泵抑制物，即内源性哇巴因（endoge-nou
