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1、荧光定量PCR技术在临床检测中的应用 黄少军市中心医院 PCR与基因诊断技术 基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法 Polymerasechainreaction PCR 聚合酶链式反应 是一种DNA的快速扩增技术 PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶的作用 可在3个小时内把特定的DNA片段扩增1000万倍 九十年代中期PCR临床应用在国内全面开展 1998年 荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测 4基因诊断 3免疫学诊断 临床诊断 细胞膜 细胞核 DNA 转录 mRNA 翻译 蛋白质 1形态学诊断 2生化诊断 概念 基本
2、原理 以DNA为例 1 DNA变性 2 降温退火 3 引物延伸 原理第一步 加热变性 预处理 第二步 引物与靶序列退火 第三步 引物延伸 第1个PCR循环完成后 得到两个拷贝的靶序列 PCRPCR exe动画 30次循环后靶序列扩增的数量 No ofNo AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201 048 576301 073 741 824 荧光PCR的原理 PCR技术的特点 灵敏度高特异性强快速简便应用范围广 Ct值的意义 Ct值与重复性同一样本在相同条件下同时进行96次扩增 FQ PCR Ct值与浓度不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同
3、感染性疾病的诊断母婴传播的控制与观察遗传疾病的诊断肿瘤的诊断法医学鉴定 荧光定量PCR的临床应用 早期诊断病情评估和预后判断抗病毒药物疗效的观察 指导新药验证 一感染性疾病1 病原体含量与病情之间的关系2 病原体含量与用药之间的关系3 药物及疗法的研究与开发4 新的病原体分子诊断标准5 新的愈后指标6 传染病发病的监控 预测与预防 临床应用 临床应用 二肿瘤1 肿瘤标志物 癌胚抗原 同功酶 抗体 激素 细胞因子 受体等2 肿瘤相关基因表达的检测 包括癌基因抗癌基因 肿瘤转移基因及转移抑制基因 三遗传病1 等位基因检测2 多基因遗传病的突变检测3 基因表达异常所致遗传病检测 1 亲子鉴定2 法医
4、物证3 PCR RFLP技术的法医学应用4 罪犯鉴定 法医鉴定 免疫学诊断主要是抗原抗体反应 应用于临床通常在体内产生抗体以后 而许多病原体的免疫学检测存在较长的 窗口期 不利于对疾病的早期诊断 PCR方法直接检测病原体的DNA RNA 能大大缩短 窗口期 其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断 疾病的早期诊断 荧光定量PCR在病原体检测中的应用 一肝炎病毒定量检测二性病病原体检测三结核杆菌及呼吸道病原体检测四优生优育 TORCH 相关项目检测 临床应用 肝炎病毒定量检测HBVHCV 临床应用 一 乙型肝炎病毒结构及特点 HBsAg 是HBV感染的主要标志HBsAb 保护性抗体HBcAg
5、仅存于感染的肝细胞核内 一般不存在于血循环中HBcAb 非保护性抗体 HBcAb IgM提示HBV处于复制状态HBeAg HBV复制及强感染性的指标HBeAb 有一定的保护作用 预后良好 HBV HBV 二 HBV DNA与 两对半 1 两对半 机体的免疫反应状态 2 携带者 大三阳 小三阳 等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度 FQ PCR 检测的是HBV本身的遗传物质 DNA 是病毒存在和复制的最可靠 最直接的指标 3 血清学指标 不能排除HBV感染 HBV 二 HBV DNA与 两对半 4 也可能出现HBsAg HBV DNA 5 HBsAb HBcAb HBeAb 三抗体阳性
6、与HBVDNA2 5 103copy ml结果解释 HBV 三 HBV DNA定量检测的临床意义 3 HBV DNA定量与预后a 含量高者急性肝炎患者易慢性化b 癌变的几率明显高于含量低者 1 HBV DNA定量与HBV复制水平及传染性 2 HBV DNA定量与乙肝药物疗效a 专家提出 103copy ml做为阴性或临床治愈标准b HBV DNA定量分析与干扰素治疗 前 中 后 c 拉咪呋啶 HBV 三 HBV DNA定量检测的临床意义 4 HBV DNA定量有助于指导怀孕与孕期 哺乳期检查 6 血液制品和献血员的筛选 HBVDNA检测的临床意义 HBVDNA是HBV存在最直接的依据HBVDN
7、A是HBV复制的标志HBVDNA是患者具有传染性的标志HBVDNA对乙肝两对半起补充作用HBVDNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标HBVDNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎 病毒特点 1 单正链RNA病毒2 E1和E2区基因高度变异性 一 丙型肝炎病毒特点 HCV 感染特点 HCV在血中含量极微输血后肝炎主要致病因子免疫学标志仅有抗 HCV 非中和抗体 产生时间不一有一部分人感染HCV后 不产生抗 HCV感染易于慢性化 50 85 疫苗研制尚不成功 单链RNA 二 HCV RNA定量检测的临床意义 1 早期诊断a 临床以 80copy ml做为无感染或治愈标准 b HCV感染1 3W 即
8、可检出HCV RNA的存在 c 严格筛选献血员 提高对窗口期感染者的检出率 HCV HCV 二 HCV RNA定量检测的临床意义 2 HCV RNA载量与抗 HCV滴度 ALT水平之间的相关性 抗 HCV滴度和ALT异常率随着HCV RNA载量升高而增加 3 HCV RNA是评价抗病毒治疗效果的重要指标 4 慢性丙型肝炎长期抗 HCV阳性 这时如果进行HCV RNA定量检测可以鉴别活动性 复制程度 二常见性传播疾病病原体 一淋球菌 NGH 二沙眼衣原体 CT 三解脲脲原体 UU 四梅毒螺旋体 TP 五单纯庖疹病毒 HSV 六乳头瘤病毒 HPV 七人类免疫缺陷病毒 HIV STD NGH 淋球菌
9、感染与致病 1 人是淋球菌的惟一宿主 2 发病率最高 在所STD疾病中 高达60 左右 3 发病趋势 a 男性多于女性 b 城市走向农村 c 高收入阶层向低收入阶层扩展 4 人对淋球菌感染无天然抵抗力 免疫不持久 再感染和慢性患者普遍存在 5 如母亲为淋病患者 婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎 CT 沙眼衣原体感染与致病 1 严格的细胞内寄生 2 不仅可致眼部感染 肺部感染 也是STD的主要病原体 3 近年来在欧美等国 沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌而居STD之首 4 在我国 在非淋球菌性尿道炎中 居首位 5 泌尿生殖道感染 妨碍妊娠 6 盆腔感染 可致生殖能力损害 UU 解脲脲原体感染
10、与致病 合成尿素酶 分解尿素 2 在非淋球菌性尿道炎其感染率仅次于衣原体感染 居第二位 3 流产超过4次以上者 检出率高达80 4 有30 40 男性尿道炎是由感染UU所致 5 与男性不育相关 男性不育患者精液中 脲原体检出率高达66 6 检出率随精子数减少和精子活动力下降而升高 1 非培养或形态学检查的诊断技术 快速 特异 敏感 2 对无症状或症状轻者 可以早期确诊 3 对NGH CT UU等混合感染者 诊断和鉴别诊断 4 指导用药 考核疗效 荧光定量PCR诊断NGH CT UU的意义 NGH CT UU NGH CT UU 荧光定量PCR诊断NGH CT UU的意义 5 不孕不育 优生优育
11、 6 流行病学调查 为性传播疾病的监控提供依据 CT UU NGH HPV TP除NGH可培养外 其余难培养或者不能培养 即使能培养 所需时间长 48小时 人乳头瘤病毒感染与致病 1 HPV具有宿主和组织特异性 只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞 人是HPV的惟一宿主 2 有100多个型 3 低危型 HPV6 11引起良性病变 尖锐湿疣 喉乳头瘤等 HPV 人乳头瘤病毒感染与致病 HPV 4 高危型 HPV16 18引起恶性肿瘤 宫颈癌 肛门癌 口腔癌等 5 免疫原性低 易形成持续性感染 6 新生儿产道感染 看看这些英年早逝的艺人 她们死于宫颈癌 宫颈癌的知晓率在不断提高 梅艳芳 40岁 国家一级
12、演员李媛媛 41岁 HPV 1 对典型病例可以明确诊断 2 对临床表现和组织病理改变都不典型的病例同样可以做出诊断 3 对亚临床和隐性HPV感染做出诊断 4 基因分型 5 考核疗效与预后 6 病毒载量与患癌症风险 HPV 荧光定量PCR检测HPV的意义 HPV 三结核杆菌与呼吸道病原体检测 TB TuberclebacilliCP ChlamydiapneumoniaMP MycoplasmalpneumoniaSARS severeacuterespiratorysyndrome 结核杆菌流行现状 1 罗伯特 科赫 德国细菌学家 结核杆菌发现者结核病是一个全球性的问题 近年来在世界范围内出现
13、流行 且呈增长的趋势 TB 结核杆菌流行现状 2 我国结核病的疫情仅次于印度而居世界第二位2000年 全国人口结核感染率为44 5 其中15 44岁人群占了53 每年约有25万人死于结核病 结核杆菌引起的感染 肺部感染 原发性肺结核 开放性肺结核 肺外感染 脑 肾 骨 关节 生殖结核 肠结核 结核性腹膜炎 全身性结核 常规结核病实验室诊断方法及不足 1 痰涂片作抗酸染色 阳性率低 费时2 细胞培养 金标准 周期太长 3 4W 3 血清学诊断 a 接种BCG可出现阳性b 不能区分活动性结核病和治愈后留下损伤灶的病人c 交叉反应 假阳性不能早期诊断 容易漏诊 误诊 TB 荧光定量PCR检测TB D
14、NA的意义 1 能稳定检测10copy的TB DNA 灵敏度高 特异性强2 早期 快速 准确地诊断结核病 痰液 肺及支气管灌洗液 肺结核血液 播散性结核和各脏器的结核病脑脊液 中枢神经系统结核病宫颈拭子 尿道拭子 泌尿生殖道结核病 TB 3 荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法 4 TB DNA浓度可用于判断疗效 痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势 TB DNA拷贝数下降 根据病原体DNA浓度 对药物治疗及疗效观察提供参考依据 TB 荧光定量PCR检测TB DNA的意义 四TORCH感染特点与检测 TOX ToxoplasmagondiiRV Rubella
15、virusCMV HumancytomegalovirusHSV Herpessimplexvirus TORCH TORCH感染特点 1 母 胎传播的主要病原体2 引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因3 自然状态下呈隐性感染4 怀孕 多次输血 AIDS等易发生显性感染5 可致多发性 全身性感染6 只有风疹可获得长久的免疫力 可用疫苗预防 TORCH 一 弓形虫感染与致病 滋养体如弓形 广泛分布 人兽共患 寄生在有核细胞中 猫和猫科动物是终宿主易感者多 免疫者少我国智力低下儿的弓形虫感染率28 畸形儿的弓形虫抗体IgM阳性率12 25 艾滋病患者约有20 80 合并弓形虫感染 造成艾滋病死亡的一个
16、重要并发病 TORCH TOX 人群自然感染率达到60 90 多为隐性感染免疫功能低下 怀孕 多次输血 器官移植 AIDS 发生显性感染可发生垂直传播 是宫内感染和胎儿畸形的主要病毒之一围生期感染血 尿 乳汁 精液 分泌物中都可检出病毒 二 人巨细胞病毒感染与致病 TORCH CMV 风疹是一种世界性的病毒传染病 是造成畸胎及先天性疾病的病毒之一出疹前1周至出疹后5天均有传染性人是风疹病毒的唯一宿主风疹感染后可获得持久的免疫力 临床显性再感染并不多见 三 人风疹病毒感染与致病 TORCH RV 先天性风疹感染往往发生在母体初次感染之时 可致先天性风疹综合症 CRS 三联症 白内障 耳聋 心脏病 妊娠时体内皮质类固醇激素的增加以及细胞免疫功能的减弱 这种对正常人无害的再感染有可能造成病毒蔓延以至影响胎儿 TORCH RV 三 人风疹病毒感染与致病 HSV原发感染多为隐性 大多无临床症状或呈亚临床表现HSV 1主要引起口唇疱疹 疱疹性结膜炎 脑炎 皮肤性疱疹HSV 2主要引起原发性生殖器疱疹 80 HSV感染后大多数个体不能彻底消灭病毒 也不能阻止复发 病毒以潜伏状态长期存在宿主体内 TO
