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1、1重组腺病毒 Ad.VSG-hBCL-2 对大鼠移植肝缺血/再灌注损伤的保护作用【摘要】 目的 探讨重组腺病毒 Ad.VSG-hBCL-2 对大鼠移植肝缺血/ 再灌注损伤的保护作用及其机制。方法 重组腺病毒 Ad.VSG-hBCL-2 通过门静脉注入实验组供体大鼠肝脏，术后 36 h 剖腹获取供肝，并将其保存在 4 乳酸钠林格液中 4 h， “双袖套法”行原位肝移植术。门静脉复流 6 h 后观测受体胆汁分泌情况，处死受体大鼠，检测血浆中天冬氨酸转氨酶（AST） 、丙氨酸转氨酶（ALT） 、乳酸脱氢酸（LDH）水平，肝脏组织中 Bcl-2 和 TNF- 表达，TUNEL 法检测肝脏组织的细胞凋亡
2、，电镜观察肝脏组织的亚细胞结构变化。结果 术后 6 h，免疫组化和 Western blot 检测显示，与对照组相比实验组肝脏组织中 Bcl-2 表达明显升高，胆汁分泌量增加， AST、ALT、LDH 水平明显降低， TNF- 表达显著增高。实验组细胞形态变化较轻，凋亡指数明显低于对照组。结论 经门静脉转染的重组腺病毒 Ad.VSG-hBCL-2 在大鼠肝脏内能够有效表达，高表达 Bcl-2 能够降低移植肝的缺血/再灌注损伤。 【关键词】 肝移植 缺血 再灌注损伤 基因转染 Bcl-2 大鼠 Abstract:Objective To study the protective effect o
3、f recombinant adenovirus Ad.VSG-hBCL-2 on the graft of liver transplantation against ischemia/reperfusion injury in rats.Methods The donor rats liver was first treated by 2injecting the recombinant adenovirus Ad.VSG-hBCL-2 via the portal vein. 36 hours later, the donor rat was re-laparotomized to re
4、move the graft liver. The graft was preserved in 4 Ringers lactate solution for 4 hours before the rat orthotopic liver transplantation (ROLT) was performed using the cuff technique. Six hours after that, the relevant liver function parameter were assayed.Results It was found that the bile flow was
5、increased in the test group rats, compared to that of the control. Immunohistochemical analysis and Western blot assay showed that Bcl-2 was overexpressed in the treated graft liver. Blood tests showed the mean levels of ALT, AST and LDH were significantly lower in the transfected liver tissue than
6、that in the control. Immunohistochemistry showed higher level of TNF- in the control liver graft. The cell morphology changes were milder and the apoptosis index was lower in the transfected graft livers than in the control.Conclusion Being administered via the portal vein, the recombinant Ad.VSG-hB
7、CL-2 can be expressed in rat livers. And in vivo, the overexpression of Bcl-2 can reduce the subsequent ischemia/reperfusion injury in the graft liver. Key words: liver transplantation; ischemia/reperfusion 3injury; gene transfer; Bcl-2; rat 肝细胞凋亡是移植肝缺血/再灌注损伤的主要机制1 。在器官移植前，将外源性凋亡抑制基因转染入移植物，并表达功能性蛋白，
8、以抑制供肝的细胞凋亡，从而减轻手术后移植肝的缺血/再灌注损伤，对提高移植肝存活时间和改善肝功能等方面具有重要意义。我们以改良“双袖套法”建立大鼠原位肝移植模型，应用重组腺病毒Ad.VSG-hBCL-2 转染供体肝脏，观测 Bcl-2 在大鼠肝脏组织中的表达及其在大鼠原位移植肝缺血/再灌注损伤中的保护作用，为探索移植肝缺血/再灌注损伤的保护方法提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂 重组腺病毒 Ad.VSG-hBCL-2（上海第二军医大学基因实验室） ， LipofectAmine2000 试剂盒（Gibco BRL 公司） ，鼠抗人 HBCL-2 单克隆抗体 Str
9、essgene： SPA810（人、鼠、兔共享） ，兔抗鼠 TNF-(Santa Cruz 公司)，免疫组化试剂盒(博士德公司)， TUNEL 试剂盒（Roch 公司） ， Western Blot 检测试剂盒(NEB 公司) 。 1.1.2 引物合成 采用 PCGENE 软件中的 PCRPLAN 程序，由基康基因公司合成。 h-BCL-2 基因上游引物： VT369 5-GGAGATAGTGATGAAGTAC-3。 h-BCL-2 基因下游引物： VT370 5-AGAGACAGCCAGGAGAAAT-3。 1.2 方法 41.2.1 动物及分组 健康雄性 SD 大鼠 220250 g，共
10、56 只。取 48 只配成 24 对，随机分成 3 组，每组 8 对，余 8 只为正常组。 正常组：只取肝脏及血液检测各项观察指标值，不做肝移植。 A 组： Ad.VSG-hBCL-2 预处理供体。 B 组：病毒空载体 Ad-EGFP 预处理供体。 C 组：0.9氯化钠溶液预处理供体。 1.2.2 供体处理方法 A 组（Ad.VSG-hBCL-2 体内转染预处理供体大鼠 ）： 术前 12 h 禁食、4 h 禁饮水，氯胺酮腹腔麻醉（80 mg/kg） 。 麻醉成功后上腹部正中切口入腹，将肠管推向左下腹，显露门静脉及肠系膜静脉。 细针穿刺肠系膜静脉，缓慢注射Ad.VSG-hBCL-2 悬液（1.5
11、1012 pfu/L） 2 ml，压迫止血 1 min后关腹。 麻醉清醒后 1 h，自由饮水、进食。 B 组：病毒空载体 Ad-EGFP 悬液（1.51012 pfu/L）2 ml 预处理供体大鼠，方法同 A 组。 C 组：0.9 氯化钠溶液 2 ml 预处理供体大鼠，方法同 A 组。 1.2.3 受体处理方法及标本采集 A 组： Ad.VSG-hBCL-2 预处理供体大鼠 36 h 后获取供肝称重（g） ，以乳酸钠林格液灌注保存，冷缺血时间为 4 h。采用“双袖套法”行原位肝移植术2 ，受体门静脉复流 6 h 后麻醉进腹，于胆总管内置入硬膜外麻醉用导管，根据导管中胆汁的长度推算每分钟的胆汁分
12、泌量，再除以供肝的质量，即为每分钟每克肝脏的胆汁分泌量（gmin-1g-1） 。硬膜外导管测量胆汁分泌量的方法：向胆总管近端插入硬膜外导管，测量每分钟胆汁引流的导管长度。导管体积测定：用微量注射器向导管5内注入 50 l 有色液体测量其长度，共 6 次，计算得 1 mm=(0.650.26)l。 从肝下下腔静脉抽血 1.0 ml，检测天冬氨酸转氨酶（AST） 、丙氨酸转氨酶（ALT） 、乳酸脱氢酸（LDH） 。切取肝左叶，置入液氮保存，备检 Western blot。 切取肝右前叶，置入 10甲醛，石蜡包埋后备检免疫组化及 TUNEL。取肝右前叶，置入 4%戊二醛溶液固定，送电镜室观察。 B
13、组和 C 组的处理及标本采集方法同 A 组。 1.2.4 标本检测 生化检测血浆中 AST、ALT 、LDH 水平，Western blot 检测大鼠肝组织 Bcl-2 表达，免疫组化方法检测肝组织中 Bcl-2 和 TNF- 表达，TUNEL 法检测肝组织的细胞凋亡，电镜观察肝组织的亚细胞结构变化。 1.2.5 细胞凋亡指数及免疫组化定量分析 采用 Image-Pro Plus 图像分析软件，切片组织在 400 倍光学显微镜放大下，摄取图像并输入分析系统，选择并测量染色阳性面积与视野面积。每张切片随机选 5 个视野，将 Bcl-2 及 TNF- 表达的阳性面积除以视野面积（） ，取其均值为“
14、阳性区域面积” 。凋亡指数：光镜下每例标本切片随机选取 5 个 400 倍视野，计算出平均每 100 个细胞中的凋亡细胞数，以百分数表示为凋亡指数（apoptotic index， AI） 。 1.3 统计学处理 数据以 s 表示，采用 SAS 统计软件包进行方差分析及两两比较，检验水准:0.05。 2 结 果 2.1 胆汁分泌量 门静脉复流 6 h 后测定胆汁分泌量，A 组与 B6组、C 组相比较明显增加，差异有统计学意义（P0.05） 。A 组与正常组胆汁量比较其差异亦有统计学意义（P0.05） 。见表 1。 2.2 各组血 ALT、AST、LDH 的检测 A 组门静脉复流 6 h 后，血
15、清 ALT、 AST、LDH 均明显低于 B 组及 C 组，差异有统计学意义（P0.01） 。B、C 两组间各项指标比较，差异无统计学意义。A组与正常组肝功能比较亦有统计学意义（P0.01） 。见表 2。表 1 门静脉复流 6 h 后胆汁分泌量表 2 各组术后 6 h 肝功能比较与正常组比较：*P0.01；与 A 组比较：#P0.01 2.3 大鼠肝脏 Bcl-2 蛋白表达 Western blot 检测，正常组大鼠肝脏组织不表达 Bcl-2 蛋白，B 组及 C 组大鼠肝脏组织仅痕量表达Bcl-2 蛋白，A 组（Ad.VSG-hBCL-2 治疗组）大鼠肝脏组织 Bcl-2蛋白表达明显。见图 1
16、。 图 1 复流 6 h 后各组肝组织内 Bcl-2 的表达 2.4 免疫组化及细胞凋亡检测 2.4.1 Bcl-2 蛋白的表达 正常组大鼠肝脏细胞 Bcl-2 蛋白无明显表达。A 组大部分肝细胞胞质染成棕黄色，而 B、C 组肝细胞偶见弱阳性表达，A 组与 B、C 组阳性表达百分率比较差异有统计学意义（P0.05） 。见表 3。 2.4.2 TNF- 的表达 正常组大鼠肝脏未见表达。B 组及 C 组可见大量肝细胞及窦内皮细胞染成棕黄色，A 组仅在少数局部范围可7见淡棕黄色的弱阳性细胞，A 组与 B、C 组阳性表达百分率比较有统计学意义（P0.05） 。见表 3。 2.4.3 细胞凋亡及 AI 正常大鼠肝脏偶见凋亡细胞。门静脉复流6
