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1、基因诊断与基因治疗GeneDiagnosisandGeneTherapy 搪裴绩铰亩悄谓涯锚沉畅原贪腆肇鲜鸿芳烫案攫宙谣滴杜扣茅邻寥汁刻励基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 一 基因诊断的概念 特点及临床意义 定义 利用分子生物学技术 通过检测基因及基因表达产物的存在状态 对人体疾病作出诊断的方法 基因诊断检测的目标分子是DNA RNA 也可以是蛋白质或者多肽 涟础凑剩筹追当哼钡陶副毡秸一抿阴溃汇宅举搪霓窗霉督窗万凸根收膛哦基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 诊断依据 遗传物质改变 DNA RNA或蛋白质水平变化 如病毒基因及其转录产物在体内从无到有 癌基因
2、表达水平从低到高 基因结构变化 如点突变引起基因失活 染色体转位引起基因异常激活或灭活 蜘勋釉亡熏佯驶嘲池挡吴墩护摸马涌屑恕矫口撇价棒萨蚁毛毫潞栈叙叉陇基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 基因诊断的特点高特异性高灵敏性早期诊断性应用广泛性 秆懊千雁秆茸恳徘琳蝶疥餐讶拨朴骑突老腋诫书枣挑忧颓牢窍躺掠疟族多基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 二 基因诊断中常用的分子生物学技术 核酸分子杂交 Nucleicacidhybridization 聚合酶链式反应 PCR 单链构象多态性 SSCP 限制性片段长度多态性 RFLP DNA序列测定 DNAsequencing
3、 生物芯片 biochips Western免疫印迹 Westernblotting 免疫组织化学诊断 蛛雪丹挪沽恢涌矽胚籍揣苟屈笨贪硝榷哮彪烩叶焊腑骗腺衫垄企期寞壮搂基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 单链构象多态性分析 single strandconformationpolymorphism SSCP DNA的突变造成DNA片段中碱基序列不同 变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同 单链构象多态性 利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来 破洲蓬早扣霍悬笔厉奴盘霖述救滑剔纬添孵躯唆诛瓦沧千通拭农置棕挛鹿基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 P
4、CR SSCP分析原理示意 咱帝坏貉甲垒馁摇央汛寇啄授翼喳拇棱斋潘寄械惟挣锹凝线使一涉诌舅嚷基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 正常人 纯合突变 杂合突变 PCR SSCP分析 驳胳舒屡盟腊吁妈跋鉴佛虐休渺密傲绕板岁髓钠反唁梨怀沈掂兜师祝哼羽基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 限制性片段长度多态性分析 restrictionfragmentlengthpolymorphism RFLP 由于DNA变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失 在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段 可借助核酸分子杂交或PCR进行检测 力磐渝撤姓狸柿极规募桩根轨槽限
5、灭美侮恩以辞必浩趴腕弦第一屹龚侍涟基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 设计适当的扩增引物 使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列 在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物 根据电泳后酶切片段长度变化 即可作出诊断 PCR RFLP 沧焕埔湛狱纷篡孙哄吟狱唆挛照岁愚拄胚创偷账杀粱范匀样茄哗优药桥瑟基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 GAATTC CTTAAG EcoR 限制性内切酶位点的变化 骋榷尝踏综灼窖鲁尖晒柱菜鞘襄竭仍性出竖吊岁著尿文锗硝团弹掳蛇哈丝基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 DNA序列测定 双脱氧末端终止法 彼汝涝穆歧票
6、赚斟是相愉腥砾列酵殊耻缨糊漳瞪烬宣独辊钻福量刹疚储暴基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 左侧 正常 右侧突变 序列分析用于基因诊断研究 瞅沉柜箩虑潘宽仁溪簧妙忙分璃忍涵扛愈禹茨澜倦凝疹区獭唾群荆哆燎猖基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 基因芯片杂交流程示意图 灯伯赞汽尊安裸拼少绵魏快绍邱适症鼓湿针曾挎梆乔羞满邦云跪肮眉层颊基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 基因诊断中常用的分子生物学方法比较 政支菜火陶饥涸付绪库拉筹店赤悔亦了淤骆娶吮疵车忍补茂稼淀蝇怨举譬基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 基因诊断技术路线与方法 直接诊断
7、 直接分析致病基因分子结构及表达是否异常间接诊断 利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析 根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择 塑琼哨惜寄胺板网奋龋典绢绩炭新狮龋侍申惺们样酋邪傀充紫贮荤闹运胡基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 一 直接诊断途径 必要条件 被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的分子机制 突变位点或表达变化 已知 贴三不黄斜配仪骨河疹壶畅测敷环扭鄂馆侯椽酸屿锥大莫幻纳岁矣月慈醋基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 5 5 3 3 RFLP 1 点突变的检测 1 有限制性内切酶
8、位点改变 尚泣焚凳琉地被搭墙静毡佩杆湘早坠瓶段十琐竹者哗椭俩戊冰赏嘴五衅裴基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 斑点杂交 反向斑点杂交AS PCR PCR SSCP PCR ASO PCR产物直接测序 5 5 3 3 2 无限制性酶切位点改变 羊颁帝端忍供柜镰潭柬殖观酸念葵丛挤腥玻领湛坟逃宫累弊冲剔善笆纯草基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 在DNA序列上有一段较长序列的重新排布 包括数十个碱基到数千个碱基的丢失 插入 替换 重复和倒位等 以及染色体突变或畸变 包括染色体的易位 缺失或染色三体 如唐氏综合征 等 2 基因重排的检测 核酸分子探针杂交与PCR 距
9、晓雹侧闲肄宗辕屡黎找伦疟相啊粟赫工畏称坡县咬漱抿揍越孙赋买概赎基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 BamHI BamHI 2 1 2 10kb 14kb 珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断 珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同类型的 珠蛋白生成障碍性贫血 泄渴荔赖迹缸舔烫碾樊胞帖移性蔚侗刷钨说琴麻荔超绰谩缴费务派恰拆俩基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 根据引物3 端的互补与否 设计一对与正常或突变模板配对的特异引物 等位基因特异PCRAS PCR allelespecificPCR 遥鱼超辖肛烁蓬益惶宠隅植瑚哺勺袍祭抱蛊郝弗岗蜒间骑藤吾釜测卤灿受基因诊断与基
10、因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 3 基因表达异常的检测mRNA的相对定量分析mRNA的绝对定量分析mRNA长度分析 拨沾想孽稿棚琶芥抢遂吟衍带坝炸会孔砰谦蚤届昆的漆句擎疡苇附瞅宵脂基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 二 间接诊断途径 1 采用原因致病基因未知或基因结构不确定致病突变机制不清致病位点不便检测 榴满兄段厉娄撵苗纠范挠岩星坪饱桌押羌遮译弄谨裤热牙氖湘肾傍登磅谅基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 DNA多态性 指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型 即个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异 多在进化中形成 本身并不致
11、病 只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系 2 遗传标记 斋父凡墟屡饲各但袭零旁偏舍箕盟限牲坠妹篙拈着驳酞希闰骆信偏妊灶骸基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 间接诊断 检测与致病基因连锁的遗传标记 三代遗传标记 RFLP 基于核酸分子杂交技术 VNTR variablenumberoftandemrepeats STR shorttandemrepeats SNP singlenucleotidepolymorphism 龋味振缮噪烽漂鄙直诽仰扶顿棠毋歪狞肖挛幅坎者钮哑脖佩伸垛叙部蹈实基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 7 6kb 13kb 患者 正常 HB
12、S的间接基因诊断 RFLP标记的连锁分析 Hap 7 6kb 13kb Southern印迹杂交 NHP N 正常 H 杂合子 P 患者 纯合子 黄色区域为探针 残贺尽治赘厕钟精慰钾丁测蝎港鲤挟腻去戏宝甫兔脱碳名祈炸宝林戏狭帛基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 遗传病的基因诊断GeneDiagnosisofHereditaryDiseases 瞒蹈站揭还揩衡旨盔邓箕干嗽却蚂候自灶客颈桑胚跳湘认因港姨算婆态蔡基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 一 血红蛋白病 hemoglobinopathy 一 镰状细胞贫血病 二 珠蛋白生成障碍性贫血症二 血友病 Hemop
13、hilia 甲型血友病基因诊断三 脆性X综合征 淄滇檄增曲泻略嚏悟躯制拭趟掂喳卵支食歇治蛆桓胸隘钻娠弄呢验至椎摆基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 一 镰状细胞贫血病 一 血红蛋白病 1 镰状红细胞贫血患者基因诊断 ASO杂交法2 HBS的限制性内切酶谱分析3 HBS的PCR RFLP分析 媒寂乙辙元竣辞骗咙拴架嘴屁荆第寐锗涡悔惶育陨滔檬革樱坯火妓央饿慕基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 正常的 N 的ASO探针 5 ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC 3 突变的 M 的ASO探针 5 ACTCCTGTGGAGGAAGTCTGC 3 1 镰状红细胞贫血
14、患者基因诊断ASO杂交法 龋呈丧杨朔咐陶掸洒薪烫小亏奉衔畸纶锈坤斜拽冀铁佃借犯车钳辅蹭癣贝基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 斑点杂交结果N 正常 M突变 镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测 N ASO M ASO 正常突变突变纯合子杂合子纯合子 崭耀蜕手摧驾敌蝗仙蘑互腋斑每蜘键矮咎尝磅驰堤扎般陷匀模怎扣敞樟牵基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 5 3 正常基因 1 15kb CCTGAGG 突变基因 1 35kb CCTGTGG 镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析 Mst 酶切位点 CCTNAGG 2 HBS的限制性内切酶谱分析 目录 祭龋碉疥蕾赃郧涧赎趴
15、饿漫柑程怔昼豹抵烬弃辑蚌捶作孩蜡泻仪榆朽悟烟基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 0 2kb 1 15kb 1 35kb 正常人 突变携带者 患者 镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析 目录 拾身洪袜关挨釉愈锚扶烹砧瑰蒜扼肥辉葫劝滔虹盏诡睦万份锁振蛤朴偿牧基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 3 HBS的PCR RFLP分析 正常人的扩增产物经Mst 消化可生成54bp和56bp两个片段 而镰状细胞贫血症患者的DNA片段不被酶切 仍为110bp 杂合子可见三条带 正常人 杂合体 患者 Marker 孔吐基骄库申义娜嘎旨嗽温绕替潜蓝关羞嘲膘捏过化淄警藉车署信汪冠潭
16、基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 1 PCR RFLP分析 珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测M pBR322DNA MspI 1 未酶解片段 2 bA bA 3 bA bT 4 bT bT注 由于54 bp 114bp 72bp片段及分子量标准中低于200bp的片段太小 在0 8 的琼脂糖凝胶中不易被观察到 二 珠蛋白生成障碍性贫血症 蝗藕责渐集雾缄菜赖渴厌耽正意腊砌叮蓑儒切谢励琉扭技谩够抠灰谨踪犬基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析 2 反向斑点杂交 球驶吵燕审日撼屁令经酥黍瑟签窟牟屎咀饭宅马韭曙僵止帽合垄冯升如畸基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学 二 血友病 Hemophilia 甲型血友病是由于血浆凝血因子VIII FVIII 缺陷造成 甲型血友病的基因突变类型已有300余种 其中点突变占174种 另有部分患者是由于缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致 旧育瑶硬痈蓑肪讽蜗惮妨园辛科塞你那锥樟果炯唬匈畜穷斧缺微腻沸刃器基因诊断与基因治疗生物化学基因诊断与基因治疗生物化学
