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1、第二章 分子生物学样品制备和检测目录2.1临床样品的采集和保存22.1.1 采样须知（3W4H）、采集原则22.1.2 采样前防护22.1.3 血液样品22.1.4 咽拭子、鼻咽拭子、咽漱液、痰液32.1.5 尿液、粪便、肛拭子32.1.6 结膜拭子、呕吐物、脑脊液、脓汁和创伤感染样品32.1.7 组织、头发42.1.8 当遇上呼吸道、消化道疾病时、进行地贫检测时42.1.9 样本的保存42.2 核酸分离纯化及鉴定52.2.1 提取原则52.2.2 操作步骤：核酸释放、分离纯化、浓缩沉淀洗涤5DNA提取5（一）酚抽提法：6DNA的沉淀：6CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）7核酸分离、纯化
2、7（二）甲酰胺解聚法：7（三）磁珠法：7（四）微柱法：8（五）试剂盒法8核酸回收的方法8质粒DNA的提取9DNA提取常见问题10RNA提取11关于RNase酶11血液样品处理12影响RNA提取的因素13RNA提取常见问题15人体九大系统（Nine human body system）：人体由九大系统组成，即运动系统、消化系统、呼吸系统、泌尿系统、生殖系统、内分泌系统、免疫系统、神经系统和循环系统。器官（Organ）组织（Tissue）：上皮组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织细胞和染色体采集原则注意生物安全样品代表性或针对性（人数较少全部采集病例人数较多时，至少采集10-20例或采集全部病例的1
3、5-20%）采集对象（尽量采集未用药的病例，采集暴露但未发病者的标本）采样时间和种类避免污染注意对样品的详细标记（每份标本都应标记患者姓名、送检号码、标本来源、具体部位、日期、时间及相关临床信息）2.1临床样品的采集和保存2.1.1 采样须知（3W4H）、采集原则采样须知（3W4H）采样的目的（why）采什么样，哪些信息（what）何时采集（when）如何采样（how to sample)采多少样（how many）如何保存（how to store）如何送样(how to deliver)2.1.2 采样前防护第一类病原微生物指能够引起人类或动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或已宣布
4、消灭的微生物。第二类病原微生物指能够引起人类或动物严重疾病，比较容易直接或间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。一、二类病原微生物标本采集人必须穿戴N95口罩、眼罩、帽子、连体式防护衣、鞋套、乳胶手套第三类病原微生物指能引起人类或动物疾病，但一般情况下对人、动物或环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。第四类病原微生物指通常情况下不会引起人类或动物疾病的微生物。生物医学样品：包括血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆液、胃液、胰液、淋巴液、粪便等样品。最常用：血浆和血清。三、四类病原微生物标本应当遵
5、循标准防护方法，并采用隔离防护措施（如手套、白大褂、口罩等）2.1.3 血液样品l血样的采集使用较多的方法是从静脉采血。根据血中药物浓度和分析方法灵敏度的要求，一般每次采血15ml。2血样的制备(1)血浆的制备：是将采集的静脉血液置含有抗凝剂的离心管中，混合后，以25003000rpm离心510min，使血浆与血细胞分离，所得淡黄色上清液即为血浆。(2)血清的制备：采集的静脉血液置离心管中，放置30min到1h。用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去凝固在试管壁上的血饼，再2 5003000rpm离心5l0min，上层澄清的淡黄色液体即为血清。(3)全血的制备：将采集的血液置于含有抗凝剂的试管中，但不经离心
6、操作，保持血浆和血细胞混合在二起，则称为全血。Hanks保存液红色无三抗无色有三抗青霉素链霉素制霉菌素2.1.4 咽拭子、鼻咽拭子、咽漱液、痰液咽部病毒聚集较多的地方用于流感、禽流感、手足口病等呼吸道及消化道病毒核酸检测或病毒分离培养最好发病3天内采集采集方法用2根无菌棉拭子沾湿红色Hanks液让患者张口发“啊”音（必要时使用压舌板），迅速地擦拭两腭弓、咽及扁桃体，避免接触舌及唾液咽漱液应在病人进食2小时后采集标本让患者先咳嗽数声，然后用3ml无菌生理盐水或肉汤漱口，漱口时让患者头部后仰，发出噢声，让采样液在咽喉部转动35秒，随后通过纸漏斗缓缓吐回到有旋转盖的50ml塑料离心管中。鼻咽拭子将棉
7、签平行于上颚插入鼻孔，伸入鼻咽部，保持几秒钟，吸收分泌物去掉尾部放入Hanks保存液同一方法采集另一侧鼻孔。棉拭子去掉尾部，放进无色Hanks液保存痰液发病早期，晨起后最好选择体温在38以上时采集嘱咐患者将痰液咳入无菌平皿中，然后用棉签刮取痰液放入3ml采样液的螺口塑料管中2.1.5 尿液、粪便、肛拭子粪便黏液脓血便应挑取黏液或脓血部分，液状粪便采集水样便或含絮状物的液状粪便25ml成形粪便取蚕豆大小粪便1块（3-5g）肛拭子肛拭子不太适用于病毒分离，只有无法取得足够量的粪便标本才使用采集方法：用保存液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门45cm深处（小儿23cm）轻轻转动一圈，直至见到拭子上有粪便
8、为止。将拭子折断，放入盛有3-4ml采集液的试管中。尿液较少用于病原学分析，但麻疹病毒、风疹病毒、腺病毒等有时也可在尿中发现，对发热伴皮疹、发热伴肝或肾功能损伤的不明原因疾病患者也可采集尿液。一般在发病时采集尿液，嘱病人用一次性杯子采集1020ml中段尿，然后倒入50mL干燥螺口管。2.1.6 结膜拭子、呕吐物、脑脊液、脓汁和创伤感染样品结膜拭子主要用于采集红眼病样品翻开眼睑，用棉拭子直接涂抹结膜，吸取分泌液，然后去掉尾部放入保存液中。呕吐物如有呕吐物第一时间采集 采样量尽可能多 洗胃液最好采集最初抽出的脑脊液临床医生采集 抽取23ml脑脊液，放入15ml离心管中。如怀疑为流行性脑膜炎需保温保
9、存，其余标本应冷藏保存。脓汁和创伤感染样品创伤样品以棉拭子直接蘸取脓汁或分泌物。脓肿样品先于患者皮肤消毒，再以无菌注射器抽取脓液，然后注入生理盐水试管；也可在切开排脓时，用棉拭子擦拭。折断拭子置于生理盐水试管。2.1.7 组织、头发组织在过量服用药物而引起的中毒死亡时，药物在脏器的贮存情况可为药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程提供重要信息，常常需要采集肝、脾、肾、肺、胃、脑等脏器及其他组织进行药物检测。处理方法：匀浆化法、沉淀蛋白法、酸水解或碱水解、酶水解法头发毛发样品可进行微量元素含量测定，可用于：药物史的估计、临床用药物和滥用药物的区别、毒性药物的检测缺点：实验材料的预处理繁杂、干扰多
10、。分析对象的含量低，需要精密仪器测定。2.1.8 当遇上呼吸道、消化道疾病时、进行地贫检测时当遇上呼吸道疾病时细菌：脑膜炎奈瑟菌、Hib、结核杆菌、军团菌、耶尔森菌等病毒：SARS、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肠道病毒、麻疹病毒、风疹病毒、乙型脑炎病毒等原核细胞类：衣原体、支原体样品类别：上呼吸道：咽拭子、咽漱液、痰液、鼻咽吸取物下呼吸道：呼吸道吸取物、呼吸道灌洗物、肺组织活检标本当遇上消化道疾病时传染病：细菌性痢疾、伤寒、副伤寒、霍乱、阿米巴痢疾、轮状病毒、诺如病毒、手足口病等食物中毒：沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌等样品种类：粪便，
11、肛拭子，呕吐物或洗胃液，血液，食物，水样，环境样当进行地贫检测时l外周血: 5mL l脐带血: 0.5-1mL l羊水：2030mL l绒毛：15mg l唾液 l组织2.1.9 样本的保存常规外周血标本，采集后做血常规，常温24小时内，4可保存1周；做血红蛋白电泳常温1周，电泳4可保存15天；DNA提取样本常温24小时，4保存1个星期，20 保存3个月，70 保存半年3年；RNA提取样本常温6小时，4保存12小时，70 保存3个月，羊水在12小时内离心可保存同上。样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室（一般不超过23h；路途遥远时，应在46h送达）样本中如加入了适当的稳定剂，如用于DNA测
12、定的EDTA抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄建议：将全血标本或DNA样本用冰袋加泡沫盒快递运送。如需提取RNA的样本需预处理后加lml Trizol在低温运送（A类感染性物质运输箱；普通运输箱）2.2 核酸分离纯化及鉴定2.2.1基本步骤1. 材料准备2. 破碎细胞或包膜内容物释放3. 核酸分离、纯化4. 沉淀或吸附核酸，并去除杂质5. 核酸溶解在适量缓冲液或水中 提取原则保证核酸一级结构的完整性；其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其他核酸分子，如提取DNA中的RNA，也应尽量去除。2.2.2 操作步骤
13、：核酸释放、分离纯化、浓缩沉淀洗涤1、核酸的释放：破裂细胞材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡2、核酸的分离与纯化：将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他物质分离：非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤DNA提取常见的标本：血液、尿液、
14、唾液、组织及培养细胞等生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存70或液氮肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA上。对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用每g核酸标本中加入0.1U的肝素，即可100%的抑制酶活性在标本中加入肝素酶I 或13 U/g核酸在于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNasin 25 下作用2小时可去除肝素的抑制作用最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集（一）酚抽提法：先用EDTA、SDS 、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100150kb。主要试剂的作用：1、EDTA：1）二价金属螯合剂，抑制核酸酶；2）降低细胞膜的稳定性2、蛋白酶K ：水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。3、SDS：1）SDS是一种阴
