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1、质粒DNA制备plasmidextraction 质粒简介 质粒 plasmid 是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子其大小范围从lkb至200kb以上不等 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位 ChromosomeDNAgenome PlasmidDNA 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物 这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值 而质粒的分离与提取则是最常用 最基本的实验技术 质粒特性 1 分子相对小2 含有高效的自主复制成分3 不相容性 incompatibility 4 转移性5 选择的
2、标记 selectivemarkers 6 限制性内切酶单一切口 质粒的结构特点 分子量相对较小共价闭合分子双链环状结构 具有更强的抗切割和抗变性能力 超螺旋DNA分子 线性DNA分子 半开环DNA分子 Plasmidvectors 表达载体 载体含有tac启动子 Lac操纵基因 SD序列 LacI阻遏蛋白基因等 Exprssionvector 细菌收集 纯化质粒DNA 细菌培养 细菌裂解 质粒DNA的提取和纯化 质粒DNA的提取和纯化 一 细菌的培养 bacterialculture l先分离单个菌落 接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增 随着细菌的生长 质粒DNA也在自主复制 对于松弛型质
3、粒 由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制 故在细菌对数生长后期 加入氯霉素 chloromycetin 抑制宿主蛋白质的合成和染色体DNA的复制 质粒DNA的复制不受影响而大量扩增 l所以使用氯霉素的主要目的 是在不减低质粒产量的前提下 减少细菌的培养体积和细菌的数量 有时质粒在细菌中的扩增状况很差 常是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致 二 细菌的收集 bacterialcollection 细胞生长过程中 排出大量代谢产物 为了提高质粒DNA的纯度 离心弃上清 细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮 漂洗l 2次 离心管壁上的液体也应该仔细去除干净 三 细菌裂解 细胞的裂解方法很
4、多 如去污剂法 沸水热裂法 碱变性法 有机溶剂法和溶菌酶法等 不同方法各有利弊 一般要根据质粒性质 宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择 质粒提取的方法 碱裂解法 Alkaline 煮沸裂解法SDS裂解法其他 质粒DNA提取方法的选择 l常用的煮沸法 碱法 SDS法均可获得较满意效果 至于有人采用碱法提取小量细菌培养物的质粒 用煮沸法或SDS法进行质粒DNA的大量分离 只是各个实验室的习惯问题 l选择哪种方法制备质粒DNA 应考虑以下因素 1 菌株类型 type 2 质粒的大小 size 3 细菌染色体DNA变性条件强弱的控制 denaturationcondition 质粒D
5、NA的小量制备2 5ml质粒DNA的大量制备500ml 大质粒 15kb 的处理方法 采用温和处理方法 使用蔗糖 溶菌酶 EDTA 后再使用SDS裂解 使plasmid损伤减少小质粒 15kb 的处理方法 无需特殊处理 碱裂解方法等均可使用 四 细菌的裂解和质粒DNA的提取 bacterialandplasmidextraction 在NaOH存在的强碱性 pH12 0 12 6 条件下 用SDS破坏细胞壁和裂解细胞 并使细胞的蛋白质与DNA发生变性 释放出质粒DNA 一 碱裂解法 Alkaline 细胞被裂解后 细胞壁 膜的碎片 变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物当pH调至中性 质粒D
6、NA重新恢复天然的超螺旋在高盐条件下沉淀 经离心分离 质粒DNA保留在上清液中 1在pHl2 0 12 6碱性环境中 线性的大分子量细菌染色体DNA变性 而共价闭环 CC 质粒DNA仍为自然状态 B将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下 染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构 大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀 而CC质粒DNA仍然为可溶状态 C 通过离心 可去除大部分细胞碎片染色体DNA RNA及蛋白质 质粒DNA尚在上清中 再用酚 氯仿抽提进一步纯化质粒DNA 碱裂解法示意图 1 4ml培养细菌收集 细菌破裂溶解 染色体基因组和蛋白质变性 质粒变性 变性的细菌基因组形成网状
7、 蛋白质变性 质粒复性 SolutionI SolutionII SolutionIII 分离 纯化质粒DNA 碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分 mainregeantsandcomponents SolutionI Tris HCl EDTA glucoseSolutionII NaOH SDSSolutionIII CH3COOH 碱裂解提取质粒可能存在的问题 少量纯化质粒是 多少菌液比较合适 2ml细菌可获得10 15 g质粒加入SolutionII后溶液应该澄清 如出现浑浊可能存在的情况 菌体量过大菌液与SolutionI混合不充分 在热或碱的条件下时间过长会导致什么结果 质粒的超螺旋
8、结构不可逆变性如 环状DNA不能被限制酶酶切迁移速率在凝胶中是超螺旋近2倍Br染色较弱等 二 煮沸裂解法 boiling 将细菌悬浮于含TritonX 100和溶菌酶的缓冲液中 TritonX 100和溶菌酶能破坏细胞壁 再用沸水浴裂解细胞 并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性 质粒DNA因结构紧密不会解链 当温度下降后 可重新恢复其天然超螺旋结构通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA 然后回收上清液中的质粒DNA 煮沸裂解法比较剧烈 只用于提取小质粒 对于会释放出大量糖类的菌株不适宜 如HB101及衍生菌 三 SDS裂解法 将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中 用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁 再用S
9、DS裂解去壁细胞 从而温和地释放质粒到等渗液中 然后酚 氯仿抽提 乙醇沉淀 洗涤质粒DNA 由于条件温和 该法特别适用于大质粒DNA 15kb 的提取 但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失 故产率不高 四 其它方法 2 牙签少量制备法 1 小量一步提取法 1 小量一步提取法直接将酚 氯仿与细菌培养物混合 然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA 最后从上清液中回收质粒DNA 本法简单快捷 成本低 提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析 二 牙签少量制备法用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA 由于制备的质粒DNA有较多污染 不能用于分子克隆中的酶学反应 但可用于质粒的鉴
10、定 质粒DNA的纯化 CsCl EB法 聚乙二醇沉淀法 柱层析法 EB CsCl密度梯度离心法 EB插入相邻的碱基之间 降低了DNA的浮力密度 但超螺旋的DNA结合EB浮力密度降低较小 仅有0 085g cm3 CsCl可以用丁醇抽提 透析除去 纯度可达100 超速离心将介质CsCl形成一连续的密度梯度 在过量EB存在下 蛋白质的密度最小位于最上层 RNA密度最大沉于管底 DNA位于中间 由于不同结构的DNA与EB结合度不一致 因此密度下降不一致 故将线性 开环 闭环的DNA区分开 EB CsCl密度梯度离心法示意图 l转基因动物 真核细胞转染及DNA外切酶酶切缺失等实验 对闭合环状双链DNA
11、的要求较高 一般还是用超速离心法纯化质粒 对于DNA片段酶切回收 内切酶图谱分析 细菌转化 亚克隆及探针放射性标记等实验 直接用小量或中量提取的DNA样品 并不需要超速离心纯化 一般可满足实验要求 2聚乙二醇沉淀法分级沉淀 首先利用LiCl沉淀大分子RNA 用Rnase酶消化小分子RNA 在利用乙二醇选择性沉淀大质粒DNA 再利用酚 氯仿抽提 方法简单实用 但是不能区分环状或开链质粒DNA 3柱层析法 以硅基质作为填充层析柱的树脂 在多盐的条件下 DNA与硅基质可逆性的结合进行纯化 多盐造成磷酸二酯骨架脱水 通过暴露的磷酸盐残基与硅基质结合 然后用50 的乙醇洗去RNA和糖类物质 再加入TE或
12、水 离心洗脱 实验步骤 取菌液1ml置离心管中 10000 12000r min 离心1min 去掉上清液 加入预冷的100ul溶液I 充分混匀 室温放置2min 加入200ul溶液II 颠倒混匀5 10次 冰上放置2min 加入150ul溶液III 颠倒混匀5 10次 冰上放置10min 10000 12000r min离心5min 取上清至新的离心管中 上清液中加入等体积苯酚 氯仿 振荡混匀 10000 12000r min离心2min 将上清转移至新离心管中 加入5mol LNaCl150ul 后加入2倍体积无水乙醇 混匀后10000 12000r min5min 去除上清液 加入0 5
13、ml70 乙醇 8000r min离心5min 清洗沉淀 干燥 加入20ulTE 溶解沉淀 1 100稀释后测定浓度 PCR 单链构型多态性分析 SingleStrandConformationPolymorphism SSCP PCR SSCP 单链DNA分子具有特定的二级空间构象 取决于该分子本身的碱基组成 突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时 不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率 从而能区别正常与突变的DNA不同顺序不同构象不同电泳行为 什么是PCR SSCP PCR SSCP是在完成靶DNA的PCR扩增之后进行单链DNA多态性分析的一种新方法 将单链的扩增DNA或组织基因组DNA通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据其电泳位置的改变可分辨出单个碱基的改变 银染原理 根据核酸分子带有多个氨基和亚氨基 一定条件下可以与银离子结合 在甲醛等还原剂的作用下 形成黑或褐色的银沉淀条带 影响PCR SSCP的因素 1 DNA片段大小2 复制错误发生3 电泳条件 1 丙烯酰胺的浓度 2 交联剂的浓度 3 电泳的物理环境 4 甘油浓度
