《豚鼠耳蜗血管交感神经支配的逆行追踪与免疫组化相结合的双标》由会员分享，可在线阅读，更多相关《豚鼠耳蜗血管交感神经支配的逆行追踪与免疫组化相结合的双标（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1豚鼠耳蜗血管交感神经支配的逆行追踪与免疫组化相结合的双标作者：申宇鹏，邱建华，乔莉，刘顺利【关键词】 螺旋蜗轴动脉；交感神经；酪氨酸单氧化酶；免疫组织化学；豚鼠【Abstract】 AIM: To investigate the detailed innervation patterns of the sympathetic nerve to the cochlear blood vessels and related neurotransmitters in the guinea pig. METHODS: The spiral modiolar artery(SMA) in guinea
2、 pig cochlea was exposed by microsurgery, then the fluorogold(FG) or horseradish peroxidase(HRP) was given around the SMA for retrograde tracing. The bilateral superior cervical ganglia(SCG) and stellate ganglia(STG) were observed to find retrogradely labeled neurons. The neurotransmitters of these
3、sympathetic fibers around SMA were ascertained by using retrograde tracing combined with immunohistochemical doublelabeled technique. RESULTS: Retrogradely labeled neurons with FG or HRP were found in the rostral half of the ipsilateral SCG. No labeled neurons were observed in the 2contralateral SCG
4、 and the bilateral STG. Most of HRPlabeled neurons in SCG were THIR positive and NPYIR positive, while none of them were CGRPor SPpositiue. CONCLUSION: The THIR positive and NPYIR positive neurons in SCG send projections to the ipsilateral cochlear blood vessels. The norepinephrine and NPY may be us
5、ed by sympathetic nerve to regulate cochlear blood flow.【Keywords】 spiral modiolar artery; sympathetic nerve; tyrosine 3monoorygenase; immunohistochemistry; guinea pigs【摘要】 目的： 研究豚鼠耳蜗螺旋蜗轴动脉接受交感神经支配的具体来源情况及与该交感神经纤维调节功能相关的神经递质. 方法： 在正常豚鼠单侧耳蜗螺旋蜗轴动脉局部滴加逆行追踪剂辣根过氧化物酶(HRP) 或荧光金 (FG)，观察双侧交感颈上神经节、星状神经节内 HRP
6、或 FG 逆标神经元的分布；采用逆标与免疫组化相结合的双重标记方法观察追踪阳性神经元是否表达酪氨酸羟化酶(TH)、神经肽 Y(NPY)、钙基因相关肽 (CGRP)或 P 物质(SP). 结果： 同侧颈上神经节内可见逆行追踪阳性神经元胞体，对侧颈上及双侧星状神经节内却未见阳性细胞；阳性神经元多同时呈 TH, NPY 阳性，但未见 CGRP 或 SP 双标的阳性神经元. 结论： 豚鼠颈上神经节内存在3TH 及 NPY 阳性神经元支配同侧耳蜗血管，去甲肾上腺素和神经肽Y 可能是交感神经节后纤维调节耳蜗血流的递质或调质.【关键词】 螺旋蜗轴动脉；交感神经；酪氨酸单氧化酶；免疫组织化学；豚鼠0 引言耳蜗
7、正常的血液供应对维持其生理功能及内环境稳定具有重要意义，已证实耳蜗微血管存在复杂的调节机制，交感神经系统、体循环血压、局部代谢产物、药物及血管活性肽等都会影响耳蜗血流. 现有研究观察到哺乳动物耳蜗接受丰富的交感神经支配1 ，且这些交感神经纤维大多是去甲肾上腺素能的. Wangemann 等2在体外实验观察到耳蜗的主要供血动脉如： 基底动脉、小脑前下动脉及螺旋蜗轴动脉的收缩都受到交感神经的调节. 邱建华等3观察到豚鼠螺旋蜗轴动脉及其放射状动脉周围均有不同程度的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫反应阳性神经纤维的分布 . 本研究旨在明确豚鼠耳蜗螺旋蜗轴动脉接受交感神
8、经节后纤维支配的具体来源情况以及与该交感神经纤维调节功能相关的神经递质，为进一步研究交感神经对耳蜗血流的调节作用奠定基础.1 材料和方法41.1 材料选用健康、耳廓反射灵敏的白色豚鼠 12 只，由第四军医大学实验动物中心提供，体质量(28050) g，雌雄不拘，自由摄取食水. 将豚鼠随机分为 3 组： 辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)追踪组；荧光金(fluorogold, FG)追踪组和对照组. 追踪用 HRP 及显色剂四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine, TMB)购自德国 Roche 公司；免疫组织化学 ABC 试剂盒、兔抗神经肽
9、 Y(NPY)及 P 物质(SP)抗体(1100)购自武汉博士德生物制品有限公司；FG 及兔抗 TH,钙基因相关肽(CGRP)抗体(15000) 均购于美国 Sigma 公司 .1.2 方法1.2.1 动物模型制作采用 20 g/L 戊巴比妥钠(40 mg/kg)肌肉注射麻醉，所有动物术前测试听觉脑干反应（auditory brainstem response, ABR）均为正常，均选择右耳手术. 手术采取右颈侧进路，切断茎突及其附着肌腱后打开听泡，暴露耳蜗并拭去底转外侧壁表面黏膜，微型钻于耳蜗底转行骨壁开窗，直径约 1.5 mm，吸除外淋巴液，高倍显微镜下去除部分基底膜及骨性螺旋板，仔细暴露
10、螺旋蜗轴动脉(spiral modiolar artery, SMA)，将浸有 1 L 追踪剂（300 g/L HRP 或 30 g/L FG 溶于生理盐水）的明胶海绵微球置于SMA 表面，术中避免追踪剂流入中耳腔，骨水泥封闭耳蜗骨窗及听5泡开口，缝合关闭伤口，应用磺胺嘧啶钠预防感染. 对照组使用生理盐水代替 300 g/L HRP 溶液.1.2.2 取材、切片 HRP 追踪组豚鼠术后存活 48 h，FG 追踪组豚鼠术后存活 7 d. 采用 20 g/L 戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，开胸经心脏升主动脉插管灌注生理盐水 200 mL 冲出血液，继之用低温(4)含 40 g/L
11、多聚甲醛的 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.4)600 mL，缓慢灌注固定 2 h. 迅速分离暴露颈交感链，取下双侧颈上神经节及星状神经节，标本用新鲜 40 g/L 多聚甲醛缓冲液后固定68 h，经 0.01 mol/L PBS 漂洗后置入 300 g/L 蔗糖磷酸缓冲液(pH 7.4，4)至沉底. OCT 胶包埋后用恒冷箱切片(CM1900, Leica, Heidelberger, Nussloch, Germany)，片厚 16 m. FG 追踪组标本切片后即可在 Olympus 荧光显微镜下观察并照相，激发光波长为 323 nm.1.2.3 免疫组化实验 HRP 追踪的切片分
12、为 5 组，采用钨酸钠加强的 TMB 法行 HRP 显色反应，观察显色结果并照相. 其中 4 组切片继续行 TH, NPY, CGRP 或 SP 免疫组织化学染色.切片经 0.02 mol/L 的磷酸盐缓冲液(pH 5.4)漂洗 10 min，用含50 mL/L 牛血清白蛋白、50 mL/L 正常羊血清和 4 g/L TritonX100的磷酸盐缓冲液封闭 2 h，清洗后分别加入兔抗 TH, CGRP(15000), NPY 或 SP(1100)多克隆抗体，4 孵育 48 h，6抗体稀释液用含 10 mL/L 牛血清白蛋白、 10 mL/L 正常羊血清和 4 g/L Triton X100 的
13、磷酸盐缓冲液配制. 生物素标记的羊抗兔 IgG 室温孵育 2 h，ABC 复合液室温孵育 30 min，DAB 显色后，轻微脱水，透明，封片，Olympus 光学显微镜观察并照相，双标染色过程中注意漂洗液 pH 值以避免 HRP 标记产物洗脱 .2 结果2.1FG 逆行追踪豚鼠耳蜗螺旋蜗轴动脉局部滴加 FG 后 7 d，同侧颈上神经节内可见 FG 标记神经元，在 323 nm 激发光下发出金黄色荧光. FG 标记神经元数量约在 516 个，绝大部分位于颈上神经节头侧或中部，大小不等(图 1). 部分 FG 标记神经元可见到明显的轴突及相对空白的核区. 对侧颈上神经节及双侧星状神经节未见FG 标
14、记神经元.2.2HRP 逆行追踪耳蜗螺旋蜗轴动脉局部滴加 HRP 后 48 h，经钨酸钠 TMB 法呈色，同侧颈上神经节内可见 HRP 标记神经元. 标记神经元呈深蓝绿色，核区明显淡染，少数神经元可见突起，高倍镜下可见胞浆内的蓝绿色颗粒(图 2 A)；手术同侧颈上神经节内HRP 标记神经元的数量约为 412 个，大小不等，形态各异，其分布与 FG 追踪组相似，几乎全部位于颈上神经节头侧半，对侧颈上神经节及双侧星状神经节内未见 HRP 标记神经元 . 对照组双侧颈上7神经节及星状神经节切片经 TMB 法染色，均未发现标记神经元.2.3HRP 逆标与 TH, NPY 免疫组化染色相结合的双重标记将
15、部分HRP 标记的切片继续行 TH 或 NPY 的免疫组化反应 . 颈上神经节内有大量的 TH 阳性神经元和 NPY 阳性神经元，多数 HRP 追踪阳性神经元同时呈 TH 阳性，HRPTH 双标神经元胞体内可同时见到深蓝绿色颗粒和棕黄染色颗粒(图 2 B,C). 多数 HRP 追踪阳性神经元也呈NPY 阳性(图 2 D).2.4HRP 逆标与 SP, CGRP 免疫组化染色相结合的双重标记将部分 HRP 追踪的切片行 SP 及 CGRP 免疫组化反应. 颈上神经节内可见 CGRP 阳性神经元，数量明显少于 TH， NPY 阳性神经元；颈上神经节内偶可见到 SP 阳性细胞，但 SP 阳性终末比较
16、密集，未见HRPSP 或 HRPCGRP 双标神经元.3 讨论耳蜗的供血主要来自椎基底动脉系统的小脑前下动脉分出的迷路动脉、耳蜗总动脉、耳蜗主动脉及前庭耳蜗动脉4. 耳蜗主动脉沿蜗底向蜗顶呈螺旋样走行，形成螺旋蜗轴动脉，其在不同位置发出的各级动脉和放射状动脉提供了包括蜗轴在内 3/4 的耳蜗血流. 已有研究证实，耳蜗螺旋蜗轴动脉和骨螺旋板周围存在酪氨酸羟化8酶及多巴胺 羟化酶阳性纤维分布 ,分布于血管周围的去甲肾上腺素能纤维可能参与耳蜗微循环的调节. 本研究观察到豚鼠耳蜗螺旋蜗轴动脉周围给予神经逆行追踪剂后，同侧颈上神经节内可见逆行标记神经元，而对侧颈上神经节及双侧星状神经节未见逆行标记神经元. 可见分布于耳蜗血管周围的交感神经节后纤维主要来源于同侧颈上神经节，这与 GilLoyzaga 等5报导的切除大鼠颈上神经节后同侧耳蜗内去甲肾上腺素浓度下降 82%相符合. 也有研究报道星状神经节对耳蜗血流的调节起主要作用，但本研究未能在双侧星状神经节内观察
