《血管钠肽抑制低氧诱导的心肌成纤维细胞的增殖和胶原合成 》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血管钠肽抑制低氧诱导的心肌成纤维细胞的增殖和胶原合成 （10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1血管钠肽抑制低氧诱导的心肌成纤维细胞的增殖和胶原合成 作者：吕顺艳朱妙章郭海涛于军 【关键词】 细胞分裂 关键词: 心钠素;血管; 肽类;低氧;心肌/细胞学;成纤维细胞;细胞分裂; 胶原 摘 要:目的 观察血管钠肽（ Vasonatrin peptide，VNP）对低氧状态下大鼠心肌成纤维细胞（CFs）增殖及胶原合成的影响，探讨其防治低氧所致心肌间质结构重建的作用机制. 方法 培养新生大鼠CFs，应用流式细胞仪分析细胞周期，以 3 H-proline 掺入率反映胶原合成速率. 结果 单纯低氧不改变 CFs 的细胞周期，但增加低浓度血清（25mLL-1 ）作用基础上的细胞增殖指数PI（S+G2
2、 /M）/（S+G2 /M+G0 /G1 ） （P0.01） ，10 -6 molL-1 的 VNP 抑制低氧诱导的 PI 增加（P0.01）.低氧可以增加基础胶原合成（增加19.6%，P0.05） ，也增加低浓度血清（25mLL-1 ）诱导的胶原合成速率（增加 37.2%，P0.01）.10-8 10-6 molL-1 的 VNP 浓度依赖性抑制低氧诱导的胶原合成速率（P0.01）. 结论 低氧增加胶原合成以及血清刺激的 CFs 的2增殖反应，VNP 抑制上述作用，从而抑制低氧引起的心肌纤维化. Keywords:atrial natriuretic factor;blood vessels
3、;peptides;anoxia;myocardium/cytology;fibroblasts;cell division;collagen Abstract:AIM To investigate the influence of vasonatrin peptide（VNP）on hypoxia-induced proliferation and collagen synthesis in cultured cardiac fibroblasts（CFs）and the pre-ventive mechanism of VNP in the interstitium remodeling
4、ofischaemic heart diseases due to hypoxia.METHODS Neonatal rat CFs were obtained by enzymatic dissociation.Cell cycle kinetics of CFs was analyzed by flow cytometry.Collagen synthesis rate was determined by measuring3 H-pro-line incorporation rate.RESULTS Hypoxia（2030mLL-1 oxygen）alone for24h didnt
5、change the cell cycle of cells cultured on serum-free medium，but significantly in-creased the proliferation index （S+G2 /M）/ （S+G2 /M+G0 /G1 ） of CFs with low concentration serum（25mLL-1 ）.VNP（10-6 molL-1 ）inhibited the effects of hypoxia on low concentration serum-induced proliferation（P0.01）.Hypox
6、ia increased basal（under nomoxide without serum）3and low concentration serum-induced collagen syntheses（un-der nomoxide with25mLL-1 serum）by19.6%（P0.05）and37.2% （P0.01）in CFs，respectively.In a concen-trate-dependent manner，VNP（10-8 10-6 molL-1 ）de-creased the incorporation of3 H-proline induced by h
7、ypoxia for24h（P0.01）.CONCLUSION Hypoxia might en-hance serum-induced proliferation in CFs and increase basal and serum-induced collagen syntheses.VNP may attenuate myocardial fibrosis induced by hypoxia by inhibiting the above effects. 0 引言 心肌梗死后纤维化是导致心脏功能异常的重要因素，纤维化的形成主要包括心肌成纤维细胞（CFs）的异常增殖和胶原沉积 .作为
8、心肌缺血后果的缺氧能够通过调节生长因子、酶、应激蛋白等的基因表达，调节心脏细胞的生长和分化1 .占心脏非心肌细胞约90%的 CFs，是心脏胶原纤维基质的细胞来源，而目前关于低氧对CFs 直接影响的报道很少.我们在培养的新生大鼠 CFs 上，观察了低氧对 CFs 生长周期和胶原合成速率的影响，以及心房肽家族新成员血管钠肽（VNP）对低氧所致的 CFs 生物学特性改变的影响，旨在4从细胞水平探讨 VNP 对低氧引起心室结构重建的防治作用 . 1 材料和方法 1.1 材料 SD 乳鼠（1 2d ）由第四军医大学实验动物中心提供. 胰蛋白酶、胶原酶、EDTA，DMEM 干粉培养基和小牛血清购自 Gib
9、co 公司;VNP 购自中国科学院上海生物化学研究所;3 H-proline 购自中国科学院上海核技术开发公司 ;流式细胞仪为 Coul-ter 公司产品，型号为 Elite ESP;LS-6500 液体闪烁计数器为美国Beckman 公司产品. 1.2 方法 1.2.1 心肌成纤维细胞培养 无菌条件下取出乳鼠心脏，剪碎，用 1.25gL-1 胰蛋白酶和 0.75gL-1 胶原酶进行梯度消化，差速贴壁 1.5h 后，吸弃未贴壁的心肌细胞，获得的成纤维细胞用含 100mLL-1 灭活胎牛血清的 DMEM 培养基培养至接近融合后传代，实验用第 34 代的成纤维细胞，接种于 96 孔板（5103 个
10、/孔）用于 3 H-proline 掺入实验或接种于50mL 的培养瓶（1105 /瓶）用于流式细胞仪分析实验.实验前以无血清培养液培养 24h，使细胞处于静止状态 .细胞纯度经波形蛋白（vimentin）免疫组化染色鉴定达 95%以上. 51.2.2 流式细胞仪测定 分别加入无血清培养基、含25mLL-1 血清的培养基或含 25mLL-1 血清和 10-6 molL-1 VNP 的培养基，于常氧（210mLL-1 ）和低氧（2030mLL-1 ）条件下继续培养，24h 后收集细胞， 700mLL-1 乙醇固定，碘化丙锭染色，用流式细胞仪测定细胞周期. 1.2.3 3 H-proline 掺入
11、实验 分别加入无血清培养基、含25mLL-1 血清的培养基或含 25mLL-1 血清和 10-8 10-6 molL-1 VNP 的培养基，各孔均加入 3 H-proline（1.85MBqL-1 ） ，于常氧和低氧条件下继续培养，24h 后用多头收集器将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，滤纸经红外线烘干后置入闪烁瓶中，加入闪烁液，用液闪计数器进行掺入量的测定. 统计学处理: 数据以 x s 表示，两组间比较用 t 检验，多组间比较采用方差分析及两两显著性检验. 2 结果 2.1 VNP 对低氧状态下 CFs 细胞周期的影响 流式细胞仪分析表明，与常氧组相比，单纯低氧并不改变 CFs 的细胞周期，但在
12、625mLL-1 血清作用基础上，低氧培养 24h 后，进入 S期的细胞百分率和增殖指数 PI 显著增加（P0.01） ，而进入 G0 /G1 期的细胞比例显著降低（P0.01 ）.10-6 molL-1 VNP 能抑制该作用，减少 CFs 进入 S 期和 G2 /M 期的细胞比例以及 PI 值（P0.01） ，使更多的细胞处于相对静止期（Tab1）. 2.2 低氧对 CFs 胶原合成速率的影响 单纯低氧 24h 后 CFs的 3 H-proline 掺入量增加 19.6%（P0.01） ，25mLL-1 血清增加常氧下 3 H-proline 的掺 入量（P0.01） ，低氧使 CFs 的掺
13、入量进一步增加 37.2%，与25mLL-1 的血清常氧培养组相比， P0.05 ） ， 13.8%（P0.05）和 18.9%（P0.01）;25mLL-1 血清刺激组，掺入量分别降低18.0%（P0.01） ，33.0% （P0.01 ）和 40.3%（P0.01）. 73 讨论 缺血缺氧性心脏病病理切片可见 CFs 的增殖和胶原沉积2 .本实验显示，单纯低氧不改变 CFs 的细胞周期，但在低浓度血清刺激的基础上，低氧显著增加处于增殖状态的细胞比例，使 PI升高，提示低氧本身可能并不刺激 CFs 的增殖，在体情况下低氧是通过影响儿茶酚胺、血管紧张素、生长因子等多种体液因子的内分泌、旁分泌作
14、用而间接促进 CFs 的增殖.已知血清中含有丰富的生长因子，在本实验中低氧显著增强低浓度血清对 CFs 的促增殖作用，说明低氧可增加 CFs 对促增殖因子的反应性 .Scannell 等3 和Derevianko 等4 的实验表明，低氧能调节细胞因子诱导的多形核白细胞的信号转导及其膜受体.因此推测，低氧的作用可能是通过影响体液因子的受体或（和）对其功能执行所必须的细胞内因子的表达来实现的.心肌胶原的过度沉积可以来自胶原生成/ 降解失衡和产生胶原的 CFs 异常增殖两方面的原因 .本实验中，低氧除了能增强低浓度血清对 CFs 的促增殖反应，还显著增加 CFs 的基础以及低浓度血清刺激的胶原合成.
15、与单纯低氧相比，在有血清存在的情况下，低氧的该作用更显著.说明低氧所致间质纤维化的两方面的原因都涉及，低氧对心肌成纤维细胞的生物学活性具有重要的调节作用. 8图 2 略 钠尿肽家族主要包括心房钠尿肽（ANP） 、脑钠尿肽（BNP） 、C-型钠尿肽（CNP ）及人工合成的 VNP 等，早期对这些肽类生理作用的研究主要集中在其利钠利尿和舒血管等方面，近来发现它们还能抑制多种细胞的增殖.值得注意的是，ANP 和 BNP 主要是由距离心肌成纤维细胞很近的心肌细胞合成和分泌的心脏激素，在缺血性心脏病时血浆水平升高5 ，提示心脏分泌的钠尿肽在低氧等病理情况下可通过旁分泌方式对 CFs 的生物学特性进行调节 .体外实验亦 表明，钠尿肽对多种血管活性物质，如内皮素和血管紧张素诱导的 CFs 的增殖具有抑制作用 6-8 .VNP 是人工合成的钠尿肽家族的新成员，它是 CNP 和 ANP 的嵌合体9 .我们以往的实验表明10，11 ，VNP 能抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖，舒张肺动脉平滑肌，并能降低肺动脉高压大鼠右心室质量/体质量指数. 本研究表明，VNP 显著抑制低氧对血清刺激的 CFs 的促增殖作
