《血管内皮生长因子反义寡核苷酸联合低分子肝素治疗小鼠膀胱癌》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血管内皮生长因子反义寡核苷酸联合低分子肝素治疗小鼠膀胱癌（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1血管内皮生长因子反义寡核苷酸联合低分子肝素治疗小鼠膀胱癌作者：范海涛，王秀岩，柴红梅，刘禄成【摘要 】 目的探讨血管内皮生长因子（VEGF ）反义寡核苷酸和低分子肝素法安明单用或联合对小鼠膀胱癌、转移的抑制作用。 方法制备小鼠膀胱癌模型 40 只，随机分为对照组、 VEGF 反义寡核苷酸（ASODN）组、VEGF 错义寡核苷酸（MSODN 组） 、低分子肝素（LMWH 组）及联合治疗组，每组 8 只，分别给予生理盐水、VEGFASODN、VEGFMSODN 、法安明及 VEGFASODN+法安明皮下注射，隔日 1 次，共 15 次。检测皮下移植瘤变化和盆腔淋巴结转移率；应用免疫组织化学的方法
2、检测肿瘤组织微血管密度（MVD） ；应用 Western 印迹的方法检查肿瘤组织 VEGF 蛋白表达。结果 MSODN、ASODN、LMWH 和联合治疗组的抑瘤率分别为2.1%、33.6%、20.1%和 45.3%；盆腔淋巴结转移率分别为62.5%、25%、25%和 12.5%；Western 印迹法检测显示，对照组和 MSODN 组表达较高水平的 VEGF；ASODN 组和联合治疗组MVD 分别为（ 11.343.03）和（10.011.25） ，与对照组（21.234.01）和 MSODN 组（18.213.36）相比，差异有统计学意义（P0.01） ； LMWH 组 MVD 为（ 13.
3、046.53） ，较对照2组和 MSODN 组降低，差异有统计学意义（P0.05 ） 。结论VEGFASODN 和法安明具有下调 VEGF 表达，抗血管生成作用；两者联合应用有协同抗肿瘤作用。 【关键词】 膀胱癌；血管内皮生长因子；低分子量肝素Abstract：Objective To investigate the inhibitory effect of vascular endothelial growth factor(VEGF) antisense oligonucleotides or/and dalteparin sodium(fragmin) on tumor growth a
4、nd metastasis of mice bladder cancer. MethodsForty mice with bladder cancer were randomizedly divided into five groups:control group,VEGF antisense oligonucleotides(ASODN) group,VEGF mismatch sense oligonucleotides(MSODN) group,low molecular weight heparin (LMWH) group,and combined group.Sodium chlo
5、ride,VEGFASODN,VEGFMSODN,fragmin,and VEGFASODN plus fragmin were given respectively(once every two days,15 times altogether).The volume and weight of subcutaneous tumors were measured,and the rate of pelvic lymphonode metastasis were detected by HE staining.The microvessel density(MVD) in tumor mass
6、 was measured by immunohistochemistry staining.VEGF protein 3level in tumor tissue was detected by Western blot assay. ResultsAfter treatment,the tumor growth inhibitory rates were 2.1%,33.6%,20.1% and 45.3%,and the rate of pelvic lymphonode metastasis were 62.5%, 25%,25% and 12.5% in MSODN, ASODN,L
7、MWH,and the combined group,respectively.Western Blot indicated that there was high level VEGF in MSOND and Control group.MVD of MSODN,ASODN,LMWH,the combined group and Control group was (18.213.36), (11.343.03), (13.046.53), (10.011.25) and (21.234.01). Difference was significant. ConclusionVEGFASOD
8、N and fragmin may downregulate VEGF gene expression and inhibit angiogenesis.Combined use of fragmin can enhance antiumor effect of VEGFASODN.Key words：Bladder cancer; Vascular endothelial growth factor; ow molecular weight heparin0 引言血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前已知活性最强的血管生成因子
9、，可促进肿瘤4血管生成，并导致肿瘤对化疗药物产生耐药，与肿瘤患者的预后密切相关1，因此，VEGF 已成为理想的抗血管生成治疗的靶点2。研究发现 VEGF 及受体的单克隆抗体对一些肿瘤具有一定疗效，但伴由血栓形成、出血倾向和高血压等并发症3,4。低分子肝素（Low molecular weight heparin，LMWH）可预防和治疗肿瘤伴发的高凝血症和静脉血栓栓塞症5。我们已经设计合成 VEGF 反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides，ASODN）和错义核苷酸（Mismatch sense oligonucleotide，MSODN ）6 ，现将VEGFASODN
10、 和低分子肝素法安明单用或联用治疗荷膀胱癌小鼠，探讨两者对肿瘤生长和转移的抑制作用及其相关机制。1 材料与方法1.1 主要试剂法安明（ Fragmin，dalteparin sodium injection）由辉瑞制药有限公司惠赠；因子相关抗原（Factor related antigen）一抗，PV9000 试剂盒，VEGF 鼠多克隆抗体IgG，美国 Zymed 公司产品。1.2 荷膀胱癌小鼠模型的建立人膀胱移行细胞癌系 T24 购自中科院上海分院细胞所；雌性 C57BL 近交系小鼠，6 周龄，体重（202）g，二级清洁动物，由吉林大学实验动物中心提供。参见文献7。用游标卡尺测量肿瘤大小，按
11、公式体积=/6长宽高，5计算肿瘤体积。取每组平均数。1.3 实验动物分组 C57BL 小鼠 40 只，随机分成 5 组，每组8 只，接种后 16h 分组给药：（）对照组：生理盐水 100l/次，环瘤皮下注射；（）ASODN 组：VEGFASODN 100l/次（33g/次） ，环瘤皮下注射；（）MSODN 组：VEGFMSODN 100l/次（33g/次） ，环瘤皮下注射；（）LMWH 组：法安明 100l/次（20IU/次） ，对侧下肢皮下注射；（）联合治疗组：VEGFASODN 100l/次（33g/ 次） ，环瘤皮下注射，法安明 100l/次（20IU/ 次） ，对侧下肢皮下注射，各组用
12、药均隔日 1 次，共给药 15 次。观察实验期间小鼠进食、精神及活动状态。治疗结束处死动物，称瘤重。采用公式：抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重 实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重100%。1.4 组织病理学检查取 10%甲醛溶液固定的小鼠肺、心、肝、脾、肾、肾上腺、胰、脑、胃、肠、盆腔淋巴结等，按各脏器正中最大切面取材。石蜡切片，制作病理组织切片，HE 染色光镜下观察和计算各脏器内有无转移瘤、转移瘤灶的数量、分布及观察各脏器有无出血改变。1.5 肿瘤组织微血管密度（ MVD）的免疫组织化学检测采用三步法，以生理盐水代替一抗做阴性对照，MVD 计数按文献8 的6方法，微血管的计数标准：因子相关抗原阳
13、性的单个细胞、一个细胞簇、血管干上的分支结构，以上情况均作为一支血管。1.6Western 印迹检测 VEGF 蛋白表达取肿瘤组织 1g，在冰上剪碎，以 14 的比例加入蛋白抽取液（10mmol/L NaHCO3，1mmol/L PMSF，1g/l Aprotinin） ，以 2000r/min 匀浆 30s2 后，于 4 ，10000g 离心 30min，收集上清，Bradford 方法蛋白定量。取 100g 总蛋白和适量标准蛋白分子量混合物，加入缓冲液，调整体积在 40l，100 变性 3min 后，用SDSPAGE 凝胶蛋白电泳分离蛋白，再将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素滤膜转
14、到丽春红液染色 2min。蛋白带出现后，于室温用去离子水冲洗硝酸纤维素滤膜 5min，软铅笔标记出标准蛋白分子量的位置。把硝酸纤维素滤膜放入面积大小相近的塑料盒中，用 5%脱脂奶封闭后，按滤膜面积大小加入 VEGF 鼠多克隆抗体IgG，置摇床平台于室温孵育 4h，用 TBS 洗涤 3 次，每次30min。按滤膜面积加入含辣根过氧化物酶标记的二抗，室温平缓摇动敷育 12h，用 TBS 洗涤 3 次，每次 30min。DAB 显色。实验重复 3 次，用 HP 3770 扫描仪扫描得到显色的蛋白带图像。1.7 数据统计与分析所有统计分析均采用 SPSS 10.0 统计软件完成。各治疗组不同时间肿瘤体
15、积大小比较采用重复测量方差分析；各治疗组瘤重、微血管密度比较采用单因素方差分析，两两比7较采用 LSD 检验。2 结果2.1 对肿瘤生长的抑制作用小鼠对治疗的耐受性较好，各组小鼠未见出血及其他的药物副作用，实验结束前无小鼠死亡。治疗后 ASODN 组、LMWH 组和联合治疗组小鼠的体重，较治疗前增加（P0.05） 。接种后 9 天全部小鼠成瘤，成瘤率为 100%。对照组和 MSODN 组小鼠成瘤率早，瘤体进行性增大；ASODN 组和联合治疗组成瘤时间较晚，肿瘤生长明显受抑制（P0.01） 。各治疗组瘤重及抑瘤率的比较见表 1。2.2 肿瘤组织的病理学检查 HE 染色光镜下观察，各组肿瘤细胞均大
16、小不等，胞浆丰富，核大、深染、大小不一，细胞形态间无明显区别。ASODN 组、联合治疗组及 LMWH 组瘤组织中有大量的坏死灶，边缘作用明显，细胞核溶解、破碎，细胞间质少于对照组和 MSODN 组。表 1 各组间瘤重和抑瘤率的比较（略）2.3 对肿瘤转移的影响： HE 染色光镜下观察，可见盆腔淋巴结转移，余脏器未见转移，见表 2。各脏器均未见出血。各组与对照组比较，差异有统计学意义（P0.05） 。8表 2 肿瘤盆腔淋巴结转移的比较（略）2.4 各组间肿瘤组织 MVD 比较 ASODN 组和联合治疗组MVD 分别为（ 11.343.03）和（10.011.25） ，与对照组（21.234.01）和 MSODN 组（18.213.36）相比，差异有统计学意义（P0.01） ； LMWH 组 MVD 为（ 13.046.53） ，较对照组和
