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1、学习目标 1 回顾植物组织培养的基本原理和该技术在生产中的应用 2 初步掌握植物组织培养过程中使用的无菌技术 3 掌握植物组织培养和花药培养的基本过程 特别是选取适宜的培养材料和培养基 4 初步掌握影响植物组织培养和花药培养的各种因素 5 掌握被子植物花粉发育的过程 1 细胞的分化 概念 在个体发育中 相同细胞的后代在形态 结构 生理功能上发生稳定性差异的过程 知识回顾 持久性 稳定性 全能性 特点 原因 基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果 遗传信息的执行情况不同 2 细胞的全能性 概念 原理 每个生物细胞都具有发育成完整生物体的潜能的特性 生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的
2、全套遗传物质 都有发育成为完整个体所必需的全部基因 受精卵 生殖细胞 体细胞 全能性的比较 菊花的组织培养 1 植物组织培养的原理 植物细胞具有全能性 2 植物组织培养的过程 细胞离体 必要条件 一定的营养物质 激素和其他外界条件 无菌 1 植物材料的选择不同的植物组织 培养的难易程度差别很大 同一种植物材料 材料年龄 保存时间长短也会影响实验结果 如菊花组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝 2 适宜的培养基 MS培养基大量元素 CHO NPS KCaMg微量元素 Zn Fe B Cu Mo Co 钴 I Mn 新铁臂阿童木 古典猛 有机物 碳源 蔗糖 特殊营养物质 甘氨酸 烟酸 肌
3、醇 维生素等 3 其他因素 pH 温度 光照等条件 3 影响植物组织培养的因素 内因 P33 外因 外因 菊花 pH控制在5 8左右 温度控制在18 22 每日用日光灯照射12h 思考 以下培养基出现的现象反应了什么问题 4 植物激素的影响 外因 P33 并非必须加入 总结 植物激素的浓度 使用的先后顺序 以及用量的比例都会影响实验结果 离体组织或细胞 植物体 细胞分裂素 生长素 愈伤组织 芽 根 细胞分裂素 生长素 细胞分裂素 生长素 制备MS固体培养基 外植体消毒 接种 培养 栽培 4 实验操作 移栽 配置各种母液 配置培养基 灭菌 流水冲洗 酒精处理 消毒液处理 不要倒插 MS固体培养基
4、成分及比例 母液4 保存 植物组织培养过程示意图 上面的示意图中还有什么地方不够完善的 试管没有做密封 污染 指在组织培养过程中 培养容器内滋生菌斑 使培养材料不能正常生长发育 从而导致培养失败的现象 细菌污染 霉菌污染 无菌操作 器皿 培养基灭菌 高压蒸汽灭菌外植体消毒 体积分数70 酒精 质量分数0 1 氯化汞手消毒 体积分数70 酒精无菌操作 超净工作台器械 灼烧灭菌激素 过滤灭菌 防细菌滤膜 月季的花药培养 1 被子植物的花粉发育 花粉 小孢子 是花粉母细胞 小孢子母细胞 经过减数分裂而形成的 因此 花粉是单倍体的生殖细胞 花粉的发育要经历 四分体时期 单核期 双核期 雄蕊 2 产生花
5、粉植株的两条途径 途径一 花粉通过胚状体阶段发育为植株 途径二 花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织 再将其诱导分化成植株 走哪条途径 主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比 人工种子是由外植体通过组织培养而获得的胚状体 然后加上人造胚乳 人造种皮而制成 外植体进行的是有丝分裂 无须通过两性生殖细胞结合而发育成的个体 属于无性生殖 3 影响花药培养的因素 一 材料的选择 花期早期时的花药比后期的更容易产生花粉植株 一般 月季的花药培养时间选在五月初到五月中旬 即月季的初花期 选择合适的花粉发育时期也是提高诱导成功率的重要因素 一般来说 在单核期 细胞核由中央移向细胞一侧的时期 花药培养成功率最高
6、 为了挑选到单核期的花药 通常选择完全未开放的花蕾 实验操作 一 材料的选取二 材料的消毒三 接种和培养 一 材料的选取 选择花药时 一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期 最常用的方法有醋酸洋红法 但是 某些植物的花粉细胞核不易着色 需采用焙花青 铬矾法 这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色 二 材料的消毒 1 花蕾用V V为70 的酒精浸泡30秒2 无菌水清洗3 无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分4 放入质量分数为0 1 的氯化汞溶液中2 4分钟 也可质量分数为1 的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液 5 无菌水冲洗3 5次用于培养花药 实际上多数未熟 由于它的外面有花萼 花瓣或颖片保护 通常处
7、于无菌状态 所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可 三 接种和培养 灭菌后花蕾 要在无菌条件下除去萼片和花瓣 并立即将花药接种到培养基上 在剥离花药时 要尽量不损伤花药 否则接种后 容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组织 同时还要彻底去除花丝 因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成 通常每瓶接种花药7 10个 温度控制在25 左右 不需要光照 幼小植株形成后才需要光照 一般经过20 30天培养后 会发现花药开裂 长出愈伤组织或释放出胚状体 将愈伤组织及时转移到分化培养基上 以便进一步分化出再生植株 如果花药开裂释放出胚状体 则一个花药内就会产生大量幼小植株 必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开
8、分别移植到新的培养基上 否则这些植株将很难分开 在花药培养中 特别是通过愈伤组织形成的花粉植株 常常会出现染色体倍性的变化 主要原因是营养核和生殖核融合造成的 植物组织培养技术与花药培养技术的异同点 注意 二核花粉粒 成熟的花粉粒中 只含花粉管细胞核和生殖细胞核 精子在花粉管中形成 三核花粉粒 有些植物的花粉 在成熟前 生殖细胞进行一次有丝分裂 形成两个精子 这样的花粉在成熟时 含有一个营养核和两个精子 两个精子和一个营养核的基因型相同 1花粉母细胞 4个小孢子 减分 有分 4个花粉管细胞核 4个生殖细胞核 有分 8个精子 影响花药培养的因素 1 主要的影响因素 材料的选择与培养基的组成 1
9、接种的花药时期 一般来说 在单核期 细胞核由中央移向细胞一侧时 花药培养成功率最高 选择完全未开放的花蕾 可挑选到单核期的花药 菌少 易消毒 花瓣松动 菌多 消毒困难 2 此外 亲本植株的生长条件 材料的低温预处理以及接种密度对诱导成功率都有一定的影响 一 材料的选取1 选择花药一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期 2 确定花粉发育时期最常用方法 醋酸洋红法 焙花青 铬矾法 注 花粉细胞核内有染色体 染色体主要由DNA和蛋白质组成 醋酸洋红为碱性染色剂 染色体容易被染色 通过染色 可以确定细胞核为单核期还是双核期 是单核居中期还是单核靠边期 一般单核靠边期的花药培养成功率最高 实验操作 二 材料的消毒三 接种和培养四 结果分析与评价1 能够通过镜检找到处于适宜的发育期的花粉 用醋酸洋红法或焙花青 铬矾法检测单核靠边期的花粉粒 2 花药出现污染的原因 1 消毒不彻底 2 接种室污染 3 人为因素的交叉污染等 3 略 2 植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是 培养基配制方法 无菌技术及接种操作等基本相同 两者不同之处在于 花药培养的选材非常重要 需事先摸索时期适宜的花蕾 花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基 对培养基配方的要求更为严格 这些都使花药培养的难度大为增加
