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1、30 03 2020 1 章分子生物学研究方法 节重组DNA技术回顾节DNA基本操作技术节RNA基本操作技术节SNP的理论与应用节基因克隆技术节蛋白质组与蛋白质组学技术 30 03 2020 2 第一节重组DNA技术回顾 一 重组DNA技术发展史上的重大事件 第一 在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者 即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质 解决了遗传的物质基础问题 30 03 2020 3 第二 50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制 解决了基因的自我复制和世代交替问题 第三 50年代末至60年代 相继提出了 中心法则 和操纵子学说 成功地破译了遗传密码 阐明了遗传信息的
2、流动与表达机制 30 03 2020 4 但是 当时由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术 科学家无法对这类物质进行直接的生化分析 随着DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展 30 03 2020 5 重组DNA技术 recombination 是应用酶学方法 在体外将不同来源的DNA分子通过酶切 连接等操作重新组装成杂合分子 并使之在适当的宿主细胞中进行扩增 形成大量的子代DNA分子的过程 30 03 2020 6 工具酶 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease DNA连接酶 DNAligase 工具酶的发现
3、和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件 30 03 2020 7 一 限制性内切酶 RE 1 概念 一类能识别和切割双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶 2 分类 I型 II型 型 30 03 2020 8 类型II 识别位点和酶切位点一致 具特异性 单体酶 性质稳定 Mg2 为辅助因子 目前已分离了数百种 类型I 识别的DNA序列长约十几个bp 酶切位点在距识别位点1kb左右处随机切割 非特异性 复合酶 无使用价值 类型 酶切位点在识别位点下游24 26bp处 非特异性 单体酶 如HgaI GACGCnnnnn 30 03 2020 9 3 II型限制性内切酶的基本特性 1 识别d
4、sDNA分子中4 8bp的特定序列 2 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 3 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 30 03 2020 10 EcoRI等产生的5 粘性末端5 G C T G A A T T C G A G 3 3 C G A C T T A A G C T C 5 EcoRI37 5 G C T G OHP A A T T C G A G 3 3 C G A C T T A A POH G C T C 5 退火4 7 5 G C T GA A T T C G A G 3 3 C G A C T T A AG C T C 5 POH 30 03 2020 11 二 D
5、NA连接酶 ligase 将两段DNA片段连接起来的酶称为DNA连接酶 1 E coliDNAligase 连接粘端 催化需要NAD 参与2 T4DNAligase 连接粘端和平端 催化需要ATP参与都不连接单链 30 03 2020 12 DNA连接酶的基本性质 30 03 2020 13 二 基因克隆的载体 克隆用载体 是指具备自我复制能力的DNA分子 常见的分子克隆载体有 病毒 噬菌体 质粒 克隆用载体的选择 具备复制原点 能够自我复制 具备适合的酶切位点 且不在原点 具有筛选指标 对抗菌素的抗性 基因产物的显色反应 30 03 2020 14 载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外
6、源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 30 03 2020 15 三 基因克隆的操作 1 从复杂的生物有机体基因组中 经过酶切消化或PCR扩增等步骤 分离出带有目的基因的DNA片段 2 在体外 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上 形成重组DNA分子 30 03 2020 16 3 感受态细胞的制备 氯化钙法 第一次摇菌 第二次摇菌 离心收集细菌 0 1MCaCl2重悬细胞 冰浴30min 离心 重悬重复一次 30 03 2020 17 4 转化 transformation 感受态细胞与连接产物轻轻混匀 冰浴30min 42
7、 水浴热激60 90s 快速冰浴2min加液体LB振荡培养 使细胞复苏 30 03 2020 18 5 筛选 screening 根据重组载体的表型 抗药性 Ampr Tetr 其他mark 互补筛选 根据DNA限制酶的酶谱分析 PCR反应 30 03 2020 19 基因克隆流程示意图 30 03 2020 20 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链 依靠无反应活性的稳定的介质 琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 和缓冲液 在电场中以一定的迁移率从负极移向正极 根据核酸分子大小不同 构型的差异 以及所带电荷的不同 可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开 一 核酸的凝胶电泳 一 基本原理 第二节DN
8、A基本操作技术 30 03 2020 21 电泳迁移率 电泳分子在电场作用下的迁移速度 与电场强度和电泳分子所带的净电荷成正比 与分子的摩擦系数成反比 摩擦系数是分子大小 极性及介质粘度的函数 支持介质 稳定 无反应活性 30 03 2020 22 二 种类1 按凝胶材料分 聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳2 按电泳装置分 水平式 琼脂糖凝胶 竖式 聚丙烯酰胺凝胶3 两种方法比较 分离效果和分离范围 操作难易 30 03 2020 23 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从红色海藻产物琼脂中提取的一种线性多糖聚合物 将琼脂糖粉未加热到溶点后凝固 便会形成良好的介质 其密度由琼脂糖的浓度所决定 特点 分辨能
9、力低 但应用范围广 适用于较大分子的分析 适于分离200bp 50kb的DNA片段 操作简便 30 03 2020 24 30 03 2020 25 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶 由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED 四甲基乙二胺 的作用下聚合而成 聚合时 由单体丙烯酰胺聚合成链状物 由交联剂甲叉双丙烯酰胺将链与链交联成网状 形成立体的不溶于水的凝胶 30 03 2020 26 特点 分辨能力高 但应用范围小 适用于较小分子的分析 适于分离5bp 500bp的DNA片段 操作复杂 核酸分子的染料 溴化乙锭 EB 因具有扁平分子的空间结
10、构 能插入到DNA分子或RNA分子的相邻碱基之间 并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光 30 03 2020 27 30 03 2020 28 30 03 2020 29 30 03 2020 30 二 细菌转化 细菌转化 transformation 是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程 提供转化的DNA菌株叫供体菌株 接受转化的DNA菌株叫受体菌株 目前常用的转化方法有CaCl2法 化学转化法 和电转化法 30 03 2020 31 感受态细胞的制备 氯化钙法 30 03 2020 32 转化 transformation 感受态细胞与
11、连接产物轻轻混匀 冰浴30分钟 42 水浴热激60 90秒 快速冰浴2分钟加液体LB振荡培养 使细胞复苏 30 03 2020 33 三 PCR基因扩增 聚合酶链式反应 polymerasechainreaction 即PCR技术 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法 30 03 2020 34 PCR特异性 即所扩增片段是由两个人工合成的引物序列决定的 30 03 2020 35 PCR反应原理 变性 退火 延伸 30 03 2020 36 反应体系的成分 耐热的DNA聚合酶 引物 dNTP 模板DNA 30 03 2020 37 温度循环参数 变性 双链DNA分子加热分离成两条单
12、链DNA分子的过程 变性温度 是指双链DNA分子50 发生变性时的温度 一般为94 95 30 03 2020 38 退火 两引物分别与两条DNA的两侧序列特异性互补 形成双链的过程称为退火 退火温度一般在50 65 之间 具体温度与引物长度 碱基组成以及浓度有关 30 03 2020 39 延伸 在适宜条件下 DNA聚合酶以单链DNA为模板 以4种脱氧核苷三磷酸 dNTP 为底物 在引物的诱导下 按5 3 方向复制互补DNA的过程 延伸温度一般为70 75 此时DNA聚合酶活性最高 30 03 2020 40 时间参数 变性时间 决定于DNA的复杂性 一般选取94 1min 因过长的高温时间
13、 会降低DNA聚合酶的活性 退火时间 一般情况下取30s 1min 因为引物比较短 延伸时间 根据扩增片段的长度而定 一般在1kb以内的片段需延伸1min 更长的片段需相应延长时间 30 03 2020 41 引物 1 引物长度在15 30bp之间 引物的退火温度Tm 4 G C 2 A T 2 碱基随机分布避免一连串相同碱基 引物本身不应存在互补序列 两条引物间也不应有互补性 尤其是3 端 30 03 2020 42 3 G C含量G C含量一般为40 60 4 引物3 端碱基的特异性 30 03 2020 43 PCR技术的特点 第一 特异性强第二 效率高第三 灵敏度高皮克 pg 10 1
14、2 量级扩增到微克 ug 10 6 水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞第四 对标本的纯度要求低血液 体腔液 洗嗽液 毛发 细胞 活组织等组织的粗提DNA 30 03 2020 44 30 03 2020 45 四 实时定量PCR 实时定量PCR技术 指利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累积速率绘制动态变化图 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程 从而测定终端产物的丰度 30 03 2020 46 荧光探针事先混合在反应管中 只有与DNA结合后才能被激发出荧光 30 03 2020 47 Repeat 非序列特异性的DNA结合的荧光探针 与双链DNA结合 与DNA结合后
15、才发出荧光 30 03 2020 48 特异性的荧光探针 特异性的荧光探针是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针 通过探针与PCR产物特异性的结合 在PCR过程中可对产物实现实时 定量检测 30 03 2020 49 TaqMan探针是一小段被设计成可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA 一般为5 50bp 并且该单链DNA的5 和3 端带有短波长和长波长两个不同荧光基团 30 03 2020 50 当探针单独存在时 由于荧光共振能量转移的作用而发生荧光猝灭 在PCR过程中 由于TaqDNA酶的5 3 外切酶活性的作用 使探针的5 端的基团被切断 加大了荧光基团间的
16、的距离 被切下来的荧光基团恢复荧光 一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生 随着扩增循环数的增加 释放出来的荧光基团不断积累 因此 Taqman探针检测的是积累荧光 d NTPs ThermalStableDNAPolymerase Primers AddMasterMixandSample Denaturation Annealing ReactionTube l 应用TaqMan探针的实时定量PCR技术 5 3 l 30 03 2020 53 实时定量PCR的绝对定量 Ct值 指PCR扩增过程中 扩增产物荧光强度首次超过设定阈值时 PCR反应所需的循环数 30 03 2020 54 模板起始浓度越高 Ct值越小Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系 Ct值与模板起始浓度的关系 如果模板浓度增加1倍 Ct值就提前1个循环到达如果模板浓度减少1倍 Ct值就滞后1个循环到达 绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度 图5 11 相对定量 两个样本中的基因表达水平进行比较 图5 12 30 03 2020 56 五 基因组DNA文库构建 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限
