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1、1茶多酚干预移植性 S180 小鼠肿瘤血管相关因子表达作者：徐力李冬云侯丽刘杰孙韬叶霈智陈信义 【摘要 】 目的 应用免疫组化法，观察茶多酚口服、静脉与局部注射三种给药途径对移植性小鼠血管内皮生长因子（VEGF） 、金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP-2）表达影响，进行茶多酚抗肿瘤新生血管生成研究。 方法 建立移植性 S180 小鼠肿瘤动物模型，随机分茶多酚口服灌胃、局部注射、腹腔注射、人参皂苷 Rg3 口服灌胃、CTX 腹腔注射对照、生理盐水肿瘤模型对照、正常空白对照 7 组，5d 后取肿瘤组织，石蜡包埋、切片，免疫组化染色观察 VEGF、TIMP-2 表达。 结果 茶多酚口服及局部注射组可明
2、显降低 S180 荷瘤 VEGF 表达水平、增加 TIMP-2 表达水平。结论 茶多酚口服、局部注射具有抗肿瘤新生血管生成作用。 【关键词】 茶多酚血管内皮生长因子金属蛋白酶组织抑制因子The Effect of Tea Polyphenol on Expression of Tumor Blood Vessels Related Factors in Transplantation S180 Mice2Abstract:Purpose To investigate the effect of tea polyphenol on vascular endogenous growth facto
3、r (VEGF) and the expression of tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP-2) in transplantation S180 mice by 3 ways of administration: oral, intravenous and local injection. Methods Transplantation S180 mice tumor models were randomly divided into 7 groups based on different tea polyphenol administ
4、ration: oral administration, local injection, intraperitoneal injection, Panaxsaponin Rg3 oral, CTX intraperitoneal injection, normal saline and blank control group. Five days later, the tumor tissue was sliced for examination with immunohistochemical method for VEGF and TIMP-2 expression. Results O
5、ral administration and local injection of tea polyphenol could markedly reduce expression of VEGF and increase expression of TIMP-2 in S180 bearing tumor. Conclusion Tea polyphenol by oral administration and local injection reveals inhibiting effect of vascular growth.Key words: tea polyphenol; vasc
6、ular endogenous growth factor; tissue inhibitor of metalloproteinase 3实验研究已经证实，茶多酚不同剂量、不同给药途径对移植性S180 小鼠肿瘤具有明显抑制作用，为探讨其作用机制，我们应用免疫组化法，选用血管内皮生长因子（vascular endogenous growth factor，VEGF） ，金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinas ，TIMP?鄄 2）作为检测指标，以判定茶多酚是否能抑制肿瘤新生血管形成。1 材料与方法1.1 动 物雄性 ICR 小鼠，体重 1
7、8g20g，购自南京中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（苏）2002?鄄 0053。1.2 药 物茶多酚，购自中国农业科学院杭州茶叶研究所，纯度 98%。人参皂苷 Rg3 为参一胶囊，每粒含人参皂苷 Rg3 10mg，购自吉林亚泰制药有限公司，批号 20030601。三健牌环磷酰胺（CTX ）购自上海华联制药有限公司，批号 020706。41.3 试 剂血管内皮生长因子（VEGF ）Ab? 鄄 3(JH121)，购自美国NEOMARKERS 公司，批号 350P302；金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP? 鄄 2）Ab?鄄 5（Clone3A4） ，购自美国NEOMARKERS 公司
8、，批号 148SP208；免疫组化超敏鼠组织试剂盒（UltrasensitiveTM S?鄄 P） ，购自福州迈新生物技术开发有限公司。1.4 仪 器TSJ?鄄 Q 全自动脱水机， BMJ?鄄型包埋机，BMJ? 鄄型病理组织包埋冷冻台，PHY?鄄型病理组织包埋漂烘仪，Reichert Histo STAT 切片机，德国产 ZEISS 三目光学显微镜。1.5 方 法1.5.1 建立小鼠肉瘤模型取 ICR 小鼠 130 只，体重 18g20g，雄性。以 S180 为瘤株进行小鼠肿瘤移植。移植方法如下：选择培养 1 周的 S180 腹水瘤小鼠，抽取乳白色腹水，血性腹水不用，加生理盐水适量稀释成514
9、 的瘤细胞悬液，调细胞数至 1108 左右，每只鼠种 0.2ml 于右前肢腋窝下，整个接种时间在 1h 内完成。1.5.2 实验分组待肿瘤生长至 100mm3300mm3 时，将荷瘤小鼠随机分为茶多酚口服灌胃、局部注射、腹腔注射、人参皂苷 Rg3 口服灌胃、CTX 腹腔注射对照、生理盐水肿瘤模型对照、正常空白对照 7 组。其中，茶多酚不同给药途径 3 组又分大、中、小 3 个剂量组。共计13 组，每组 10 只。1.5.3 给药剂量与方法茶多酚口服灌胃组：采用人与实验动物剂量换算法确定大剂量组为 6.75mg/d、中剂量组为 2.25mg/d、小剂量组为 0.75mg/d 。生理盐水配制，每天
10、灌胃 0.4ml。茶多酚腹腔注射组：按茶多酚小鼠腹腔注射 LD50 换算大剂量组为 2.4mg/d、中剂量组为0.8mg/d、小剂量组为 0.27mg/d。生理盐水配制，每天注射0.2ml。茶多酚局部注射组：大剂量组为 7.2mg/d、中剂量组为2.4mg/d、小剂量组为 0.8mg/d。生理盐水配制，每天注射0.1ml。人参皂苷 Rg3 对照组：0.1mg/d 生理盐水配制，每天灌胃 0.4ml。CTX 对照组：按每天 50mg/kg 腹腔注射给药，每天注射 0.2ml。生理盐水肿瘤模型对照组：以 0.4 ml/d 生理盐水灌6胃。正常空白对照组：以 0.4 ml/d 生理盐水灌胃。按照抗肿
11、瘤药物药理实验方法规定，通常合成化合物、天然产物的纯品给药 5 次，故连续用药 5d，于第 6d 处死小鼠，并迅速取材，制备标本。1.5.4 检测方法随机选择 12 组中每组 8 只 S180 荷瘤小鼠肿瘤组织，常规石蜡包埋，HE 染色病理观察。另取抑瘤效果较好的茶多酚局部注射大、中剂量组、腹腔注射中剂量组、口服灌胃中剂量组及 CTX 腹腔注射组、人参皂苷 Rg3 口服灌胃组与模型对照组石蜡切片分别进行免疫组化染色，以检测 VEGF、TIMP?鄄 2 阳性率。染色步骤如下：石蜡切片脱蜡和水化后，用 PBS（pH7.4 ）冲洗 3 次，每次 35 min。根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应
12、的修复。每张切片加 1 滴或 50l 过氧化酶阻断液（试剂 A） ，室温下孵育15min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS 冲洗 3 次，每次5min。除去 PBS 液，每张切片加 1 滴或 50l Ultra V Block（试剂 B） ，室温下孵育 5min；PBS 冲洗 4 次，每次 5 min。除去PBS 液，每张切片加 1 滴或 50l Rodent Block（试剂 C） ，室温下孵育 60min70min。 PBS 冲洗 4 次，每次 5min。除去 PBS 液，每张切片加 1 滴或 50l 的第一抗体，4过夜。PBS 冲洗 4 次，每次 5min，除去 PBS 液，每张切片
13、加 1 滴或 50l 生物素标记的第二抗体（试剂 D） ，室温下孵育 10min15min。PBS 冲洗 4 次，7每次 5min。除去 PBS 液，每张切片加 1 滴或 50l 链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液（试剂 E） ，室温下孵育 10min15min。PBS冲洗 4 次，每次 5min。除去 PBS 液，每张切片加 2 滴或 100l 新鲜配制的 DAB 溶液。显微镜下观察 3min10min。染色结果为棕色。自来水冲洗，苏木素复染，PBS 或自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。1.6 统计学处理VEGF 和 TIMP?鄄 2 实验数据为等级资料，采用 Ridit 检验。当P
14、0.05 时，表示有统计学意义。2 结 果2.1 血管内皮生长因子测定光学显微镜下观察，VEGF 阳性细胞为棕黄色颗粒状，阳性表达位于细胞浆。染色结果判定：瘤细胞中阳性5%为（+） ，5%15% 为（+ ） ， 15%为（+ ）3。结果见表 1。由表 1 可以看出，茶多酚局部注射大、中剂量组、人参皂苷Rg3 组 VEGF 表达与肿瘤模型对照组比较有统计学意义8（P0.05） ；口服中剂量组及 CTX 组与肿瘤模型对照组比较有统计学意义（P0.01） 。而茶多酚腹腔注射组与肿瘤模型对照组比较无统计学意义（P0.05） 。2.2 金属蛋白酶组织抑制因子测定以免疫组织化学法半定量判断，TIMP?鄄
15、2 阳性细胞为棕黄色颗粒状，阳性表达位于细胞浆。癌组织中未见阳性细胞为（） ，阳性细胞在癌细胞团中1/3 为（+） ，1/32/3 为（+） ，2/3 为（+）4。结果见表 2。由表 2 可以看出，茶多酚局部注射大、中剂量组、口服组及CTX 组 TIMP?鄄 2 表达与肿瘤模型对照组相比，有统计学意义（P0.01） ，说明茶多酚可明显增加 S180 荷瘤鼠 TIMP?鄄 2 表达水平，具有抗肿瘤新生血管生成作用。而茶多酚腹腔注射组与肿瘤模型对照组比较无统计学意义（P0.05） 。3 讨 论血管内皮生长因子（VEGF ）是一种对血管生长有强诱导作用的生长因子，具有刺激血管内皮细胞增殖及新生血管生
16、成作用。VEGF几乎在目前已知的所有肿瘤中都表达，阻断 VEGF 介导的血管生成9将来可能变为治疗肿瘤生长和扩散的常规手段5。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类含锌的蛋白水解酶，在肿瘤新生血管生成过程中，MMPs 参与细胞间和基底膜结缔组织的更新和重组。因此，MMPs 抑制剂是一类重要的血管生成抑制剂，TIMP作为金属蛋白酶抑制剂可以抑制肿瘤新生血管形成。金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP?鄄 2）是一种血管生长抑制因子，在血管生成过程中起着重要的作用。另外，基质金属蛋白酶在肿瘤的侵袭和转移过程中担任了重要的角色，通过抑制阻断 MMPs 的生物活性可以达到阻碍肿瘤转移的目的4，5。环磷酰胺（CTX）属于细胞周期非特异性抗肿瘤药，有强烈的细胞毒作用，能抑制肿瘤细胞和一切增生迅速的组织（如骨髓、淋巴组织及肠黏膜上皮
