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1、1腹腔注射肉毒毒素 A 抑制 CCI 模型大鼠机械性触诱发痛和热痛觉过敏的形成【摘要】 目的 研究肉毒毒素 A（Btx-A ）对神经病理性疼痛模型大鼠的镇痛作用，并探讨其可能机制。方法 采用大鼠坐骨神经结扎（CCI）模型，雄性 SD 大鼠 50 只随机分为 5 组（n=10）：sham+saline 组，行假手术，腹腔内注射生理盐水；sham+Btx-A 组，行假手术, 腹腔内注射 Btx-A(30 U/kg)；CCI+saline 组；CCI+Btx-A(15 U/kg)组；CCI+Btx-A(30 U/kg)组；其中组制作 CCI 模型。各组皆于术后即刻腹腔给药，于术前和术后 1、 3、5
2、、7 、14 天观察机械缩足反射阈值和热刺激反射潜伏期的变化。结果 神经病理性疼痛模型组大鼠术后第 4天形成稳定的机械性触诱发痛和热痛觉过敏，腹腔给予肉毒毒素 A大鼠机械缩足反射阈值和热刺激反射潜伏期与 sham+saline 组相比无显著性差异。结论 腹腔给予肉毒毒素 A 能抑制神经病理性疼痛大鼠机械性触诱发痛和热痛觉过敏的形成。 【关键词】 肉毒毒素 A 机械性触诱发痛 热痛觉过敏 腹腔注射 神经病理性疼痛 大鼠 Abstract:Objective To evaluate the analgesic effects of peritoneal injection of botulinum
3、 toxin type A (Btx-A) in rat model of neuropathic pain.Methods 50 male Sprague-Dawley rats were randomly assigned to five groups for varied 2purposes: sham-NS, sham-Btx-A, CCI-NS, CCI-Btx-A 15 mg/kg and CCI-Btx-A 30 mg/kg. Chronic constriction injury (CCI) of the sciatic nerve was performed in rats
4、to form the model of neuropathic pain, with Btx-A or NS ip given immediately after the surgery. Mechanical allodynia and thermal hyperalgesia were tested before surgery and 1, 3, 5, 7, 11 and 14 days afterwards.Results Btx-A ip after the surgery reduced or completely abolished the enhanced sensitivi
5、ty associated with the neuropathy. This reduction was significant on 5 d (anti-allodynic) and 7 d (anti-hyperalgeaia).Conclusion Peritoneal injection of Btx-A can inhibit the development of mechanical allodynia and thermal hyperalgesia in the rat model of neuropathic pain as an analgesic agent. Key
6、words: botulinum toxin type A (Btx-A); mechanical allodynia； thermal hyperalgesia； peritoneal injection； neuropathic pain； rat 肉毒毒素 A 由肉毒杆菌产生，属于外毒素，是生物制剂当中毒性极强的毒素。肉毒毒素 A 和位于运动神经末梢上的受体结合后，进入末梢神经抑制乙酰胆碱的释放从而使肌肉松弛1 。利用这一原理，临床上将肉毒毒素 A 用于治疗因肌肉过度收缩的疾病。近年来将肉毒毒素 A 用于神经病理性疼痛的治疗，诸如带状疱疹后遗神3经痛、偏头痛、侧索硬化症等疾病。大鼠坐骨神
7、经结扎（chronic constriction injury of sciatic nerve， CCI）模型是目前公认的神经病理性疼痛模型，本实验通过腹腔注射肉毒毒素 A 对 CCI 模型大鼠行为学的影响，来探讨肉毒毒素 A 对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用。 1 材料和方法 11 动物和模型制备 Sprague-Dawley 大鼠，体重 220 g 左右，由徐州医学院实验动物中心提供。参照 Bennett 等方法建立CCI 模型。大鼠在戊巴比妥麻醉下，于左侧大腿中部切开，暴露坐骨神经，于坐骨神经干上用 4-0 丝线结扎 4 道松紧适中的结，以不影响神经的血液循环为原则，每 2 道之间间隔
8、1 mm,然后生理盐水冲洗切口，逐层缝合切口。假手术组仅暴露坐骨神经不作结扎2 。12 药品、试剂及仪器 肉毒毒素 A 购于兰州生物制品研究所（GMPNOS.C0868, S10970037, 2002501） ，每支含纯肉毒毒素A 制剂 100 U。麻醉用水合氯醛购于美国 Sigma 公司。用于测定机械性触诱发痛的 Von Frey 细丝购于美国 Stoelting 公司。热刺激仪BME2410A，中国医学科学院生物工程研究所生产。 13 动物分组及给药 SD 大鼠 50 只，随机分为 5 组，每组 10只，即：假手术+生理盐水组（sham+saline 组） ；假手术+肉毒毒素 A 组（3
9、0 U/kg） （sham+Btx-A 组） ；CCI+ 生理盐水组（CCI+saline 组） ；CCI+肉毒毒素 A（15 U/kg）组CCI+Btx-4A(15 U/kg)组 ；CCI+肉毒毒素 A（30 U/kg）组CCI+Btx-A(30 U/kg)组 。给药组均于 CCI 模型建立后即时给药。 14 行为学测定 分别用 von Frey 细丝测定大鼠的机械性缩足反射阈值（mechanical withdrawl threshold, MWT）和热辐射法测定大鼠热缩足反射潜伏期（thermal withdrawal latency, TWL）以评价大鼠机械性触诱发痛和热痛觉过敏。分别
10、在术前当天和术后1、3 、5 、 7、14 天测定 MWT 和 TWL。每一次都是先测定机械性缩足反射阈值，再测定热缩足反射潜伏期（因 von Frey 细丝对大鼠是非伤害刺激） 。 1.4.1 MWT 的测定 用 von Frey 细丝以 up-and-down 法推算50%缩足阈值：将一有机玻璃箱（22 cm12 cm22 cm）置于金属筛网上，安静 15 min 后用 von Frey 细丝垂直刺激大鼠后肢手术侧足底中部，持续时间4 s,大鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，反之为阴性反应3 。测定首先从 2 g 开始，当此力度的刺激不能引起阳性反应，则给予相邻大一级力度的刺激；如出现阳性
11、反应则给予相邻小一级力度的刺激，如此连续进行，直至出现第 1 次阳性反应和阴性反应的交界值，再连续测定 4 次。最大力度为 60 g。每次间隔时间为 30 s。 142 TWL 的测定 将有机玻璃箱置于 3 mm 厚的玻璃板上，按 Hargreaves 法用热刺激仪照射大鼠足底。照射开始至大鼠出现抬腿回避时为热缩足反射潜伏期（TWL） 。自动切断时间为 30 s，以防止组织损伤。每只大鼠测定 5 次，每次间隔 3 min，取后 3 次5平均值为大鼠 TWL 值。 15 统计学处理 采用 SPSS13.0 统计软件进行数据分析。数据以s 表示，组内比较采用 t 检验，组间比较采用单因素方差分析，
12、P0.05 认为差异有统计学意义。 2 结 果 21 MWT 测定结果 与假手术组相比， CCI+saline 组在术后第 4 天到 14 天 MWT 明显下降，差异有统计学意义。 CCI+Btx-A（15 U/kg）组和 CCI+Btx-A（30 U/kg ）组 MWT 升高，与CCI+saline 组相比差异有统计学意义(P0.05)。见表 1。 22 TWL 测定结果 与假手术组相比， CCI+saline 组在术后第4 天到 14 天 TWL 明显下降,差异具有统计学意义， CCI+Btx-A（15 U/kg ）组和 CCI+Btx-A（30 U/kg）组随着时间的延长TWL 逐渐升高
13、，与 CCI+saline 组相比有统计学意义 (P0.05)。见表 2。表 1 每组大鼠各时点 MWT 表 2 每组大鼠各时点 TWL 与sham+saline 组同期比较：*P0. 05, *P0.01 3 讨 论 肉毒毒素 A 已用于神经病理性疼痛的治疗，如偏头痛、肌肉骨骼性疼痛、难治性三叉神经痛等4 ，取得了满意的临床疗效，然而关于其机制知之甚少。目前研究认为，CCI 模型可以引起痛觉过敏（hyperalgesia，简称痛敏） 、触诱发痛（ allodynia）和自发痛（spontaneous pain）等类似临床的慢性疼痛症状，近年来已成为应用最广泛的神经病理性疼痛模型之一。 6在过
14、去的研究中，人们作了大量的研究工作，证实了肉毒毒素A 外周给药能抑制疼痛的发生，但肉毒毒素 A 是否具有全身作用不得而知。在此背景下，我们开始设计实验观察腹腔注射肉毒毒素 A的效应。在本研究中，我们观察到腹腔注射肉毒毒素 A 能够抑制大鼠机械性触诱发痛和热痛敏的形成；并且随着剂量的不同，对疼痛的抑制程度也不同。腹腔注射肉毒毒素 A 起到镇痛效应，可能通过以下几条途径起作用：一是肉毒毒素 A 吸收后经血液循环作用于外周伤害性感受器，影响动作电位的发生和传导，从而阻断了疼痛信号的传导，起到抗痛作用；二是肉毒毒素 A 吸收后经血液循环作用于中枢部位，抑制了中枢敏感化，从而使痛阈增高；三是通过干预免疫
15、机制起到抗伤害作用；四是肉毒毒素 A 吸收后经血液循环作用于全身骨骼肌，通过阻断接头前膜乙酰胆碱的释放，使骨骼肌麻痹起作用。在临床工作中，由于肉毒毒素 A 的应用剂量较小，所以通过全身作用的机制起作用的可能性较小。至于其确切镇痛机制，有待于以后的研究与探索。 至于肉毒毒素 A 的作用机制，人们提出了很多可能的假说，研究发现可能是通过抑制谷氨酸、SP 和降钙素基因相关肽（CGRP ）等神经递质的释放，减少了辣椒素受体（TRPV1）的表达，从而抑制了外周敏感化。本实验证实了肉毒毒素 A 能抑制痛敏的形成。也有研究表明，在神经病理性疼痛中免疫系统也起着极为重要的作用。缺乏成熟 T 细胞的大鼠很少发生
16、痛觉过敏。另外，细胞因子、白细胞介素1、白细胞介素 6 和肿瘤坏死因子 - 在神经病理性疼痛7中起作用5 。在 CCI 模型中，由于铬制肠线的刺激，产生坐骨神经炎性反应，在该模型中，外来肠线的刺激是惟一的免疫机制。外周神经损伤引发瀑布式的免疫反应，神经损伤导致巨噬细胞浸润，T 细胞激活，促炎性反应细胞因子表达增加。 【参考文献】 1 Klein AW. The therapeutic potential of botulinum toxinJ . Dermatol Surg，2004，30（ 3）：452-455. 2 Luvisetto S, Marinelli S, Cobianchi S, et al. Anti-allodynic efficacy of botulinum neurotoxin A in a model of neuropathic painJ. Neuroscie
