《脐血源树突状细胞促进T细胞对 肿瘤细胞的杀伤效应》由会员分享，可在线阅读，更多相关《脐血源树突状细胞促进T细胞对 肿瘤细胞的杀伤效应（18页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1脐血源树突状细胞促进 T 细胞对 肿瘤细胞的杀伤效应作者：曲新栋曲政海，左建新，孙立荣【摘要 】 本研究探讨人脐血单个核细胞体外诱导分化的树突状细胞（DC）促进 T 细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。 利用淋巴细胞分离液密度梯度离心法获取脐血单个核细胞，经贴壁法获得脐血贴壁的单个核细胞，经粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF ） 、白介素4 （IL4 ）体外诱导分化为脐血 DC。用间接免疫荧光法检测 DC，MTT 法检测 DC 活化的 T 细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。试验组加 DC, DC 与肿瘤细胞的比例分别为 201、501 、1001 ，对照组不加 DC。结果表明： 脐血单个核细胞经 GMC
2、SF、IL4诱导后，第 15 天在倒置显微镜下可见典型形态的 DC。荧光显微镜下，CD1a+细胞率为（43.125.83 ）%。各实验组与对照组比较，实验组 DC 刺激的 T 细胞对肿瘤细胞的杀伤效应均高于对照组，差别均具有显著性（P0.01） 。1001 组与 501 组比较，对肿瘤细胞的杀伤效应差别无统计学意义（P0.05） ；1001 组对肿瘤细胞的杀伤效应低于 201 组，差别有统计学意义（ P0.05） ；501 组对肿瘤细胞的杀伤效应低于 201 组，差别有统计学意义（P 0.05） 。 结论： 人脐血单个核细胞体外经细胞因子诱导分化2培养的 DC 可促进 T 细胞对肿瘤细胞的杀伤
3、效应。 【关键词】 脐血单个核细胞树突状细胞肿瘤细胞免疫功能Enhancing Effect of Dendritic Cells Derived from Human Cord Blood on T Cells in Killing Tumor CellsAbstract Dendritic cells (DCs) derived from bone marrow cells are specialized cells for the uptake, processing, and presentation of foreign and selfantigens. The study ind
4、icated that retransfusion of DCs pulsed with tumorassociated antigen can induce an vigorous specific antitumor response in clinic. The present study was aimed to investigate the enhancing effect of DCs derived from human cord blood on T cells in killing tumor cells. Human cord blood mononuclear cell
5、s were isolated from human cord blood by density gradient centrifugation using lymphocyte separating medium, and cord blood mononuclear cells were obtained by adherence and cultured in a liquid culture system with GMCSF and IL4 for 15 days. Then the cells were analyzed for phenotypes of CD1a by indi
6、rect immunofluorescence. The capacity of DCs to initiate T 3celldependent antitumor immune responses was assayed by MTT kit. The ratios of DCs to tumor cells in experimental groups were 201,501 and 1001 respectively. The DCs were not added in control group. The results indicated that in the presence
7、 of GMCSF and IL4, the DCs with typical morphological features at days 15 were observed. At that time, (43.125.83)% CD1a+ cells were obtained. In addition to these phenotypic properties, the DC of experimental groups could remarkably initiate T celldependent antitumor immune responses with different
8、 ratios compared with control group ( P0.01) ， there were no significant difference of killing effects between 1001 and 501 groups (P 0.05), and killing effect of DC in 201 group was higher than that in 1001 or 501 groups (P0.05). It is concluded that human cord blood mononuclear cells can serve as
9、a better source of DC, which can promote the capacity to initiate T celldependent antitumor immune responses.Key words cord blood； mononuclear cell； dendritic cell； tumor cell； immune functionJ Exp Hematol 2007; 15(3):586-5904树突状细胞（DC）具有强大的抗原呈递和处理功能，已成为恶性肿瘤免疫治疗关注的焦点。本研究旨在探讨人脐血单个核细胞在GMCSF、IL4 等细胞因子作用
10、下体外诱导分化的 DC 对人肿瘤细胞 的杀伤效应及其机制，为恶性肿瘤的免疫治疗提供新的理论依据。主要器材3111 型 CO2 培养箱（美国 Forma Scientific 公司产品）,24 孔细胞培养板（美国 Costar 公司产品）,IX70 型倒置显微镜（日本Olympus 公司产品）,BH2 型荧光显微镜（日本 Olympus 公司产品）, SWCJ1F 型净化工作台（苏州净化设备厂公司产品）, -80低温冰箱（美国 Forma Scientific 公司产品）,550 型酶标仪（美国 BioRad 公司产品） 。主要试剂神经母细胞瘤细胞株 SKNSH 由中国科学院上海生命科学研究院提
11、供,RPMI 1640 培养液和胎牛血清购自 Hyclone 公司, Ficoll淋巴细胞分离液（相对密度 1.077）购自中国医学科学院生物工程研究所,重组人白细胞介素4 （rhIL4 ）购自美国 Promega 公司,5重组人粒 巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF ）购自哈尔滨医药集团生物工程有限公司,鼠抗人 CD1a 单克隆抗体和 FITC 标记的兔抗鼠 IgG 均购自协和干细胞基因工程有限公司。标本采集脐血取自青岛大学医学院附属医院产科健康足月顺产新生儿。脐血单个核细胞（CBMNC）的制备 1肝素钠抗凝的脐血 5 ml，加入 5 ml RPMI 1640 培养液等体积稀释。将稀释脐血
12、以 31 沿管壁缓慢加至淋巴细胞分离液上面。 1500g 离心 20 分钟。离心后上层与中层交界处混浊的灰白色层即为单个核细胞层。用尖头滴管轻轻插入灰白色层，吸出该层的单个核细胞。将 RPMI 1640 培养液加入 Ep 管中混匀单个核细胞悬液， 13 300g 离心 5 分钟 ,弃去上清，重复洗涤 2 次。用 RPMI 1640培养液调整单个核细胞悬液浓度为 1107/ml，分成 2 份，其中 1份用作于 DC 的诱导分化，另 1 份用作于 T 细胞的分离。DC 的诱导分化取 24 孔培养板，每孔加入 1 107 单个核细胞，终体积为 2 6ml。37、5% CO2、饱和湿度培养箱中孵育 3
13、 小时。轻摇培养板，吸弃细胞悬液，洗去非黏附细胞，获得黏附细胞。加入含rhGMCSF 终浓度为 100 ng/ml，rhIL4 终浓度为 100 ng/ml 的RPMI 1640 培养液 2 ml，于 37、5% CO2、饱和湿度培养箱内培养 15 天。第 7 天半量换液，补充细胞因子至原浓度，第 15 天收获， 13 300g 离心 5 分钟，弃去上清，获得沉淀细胞。用 RPMI 1640 培养液调整不同的细胞浓度以备用。DC 的鉴定采用间接免疫荧光法鉴定 DC。加入鼠抗人 CD1a 抗体（一抗）50 l，混匀，4孵育过夜。 用 PBS 洗涤 2 次，加入 FITC 标记的兔抗鼠抗体（二抗）
14、50 l，混匀，4 孵育 30 分钟。以 PBS 洗涤2 次, 取 1 滴细胞悬液滴于载玻片上，加盖盖玻片。在荧光显微镜下先用普通透射光计数视野中的单个核细胞，然后用紫外光计数同一视野中的荧光阳性细胞，计算 DC 的百分率。T 细胞的尼龙棉柱法分离将 0.5 ml 单个核细胞悬液加入尼龙棉柱内，平放尼龙棉柱，以滴管伸入柱内近尼龙棉界面，滴加 0.2 ml 预温至 37 的含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养液后封口，平置于 37温箱中孵育 307分钟，用预温至 37的上述溶液 5-10 ml 洗柱,再用 20-25 ml 上述溶液充分洗去残留的 T 细胞，洗下的悬液即为分离的 T 细
15、胞。T 细胞的冻存及复苏将 T 细胞悬液 750g 离心 5 分钟, 弃去上清。向沉淀物中加入由1 份 DMSO 和 9 份 RPMI 1640 培养液配制而成的冻存液，使细胞密度为 1107/ml。先将冻存管放在 4冰箱 45 分钟, 然后置于-20 60 分钟，最后将冻存管投入液氮中保存。恒温水浴箱温度调至 37。从液氮中取出冻存管，迅速投入 37 温水中快速晃动，直至冻存液完全溶解。将冻存 T 细胞悬液移入离心管中，加入 5 ml RPMI 1640 培养液，轻轻吹打均匀。将细胞悬液 750g 离心 5 分钟, 弃去上清。向细胞沉淀物中加入培养液，轻轻吹打均匀，调整到所需的浓度备用。肿瘤
16、细胞的培养本实验采用神经母细胞瘤细胞作为靶细胞。神经母细胞瘤细胞培养于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养液中，置 37、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，细胞贴壁生长，每 6-7 天传代 1次。传代时，用滴管吸弃培养液，用 PBS 洗涤 1 次，加入 2.5胰酶，37培养箱中消化 3-5 分钟，用倒置显微镜观察细胞消化的情8况，待细胞回缩变圆，加入培养液中止消化，用滴管轻轻吹打，使贴壁的细胞从瓶壁充分游离下来，形成细胞悬液。将细胞悬液收集到离心管中， 750g 离心 5 分钟，弃去上清，用 RPMI 1640 培养液调整细胞的浓度。实验时取对数生长期细胞。用 0.1%台盼蓝拒染法鉴定活性在 98%以上。DC 刺激的 T 细胞对肿瘤细胞的杀伤效应以 RPMI 1640 培养液调整 T 细胞浓度为 1
