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1、1胚胎植入前遗传学诊断(Preimplantation Genetic Diagnosis ,PGD)一、定义胚胎种植前遗传学诊断(PGD)是指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎进行种植前活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的诊断方法，可有效地防止有遗传疾病患儿的出生。植入前遗传学诊断是随着人类辅助生殖技术，即“试管婴儿”技术发展而开展起来的一种新技术，它是产前诊断的延伸，遗传学诊断的又一更有希望的新技术。二、意义（一） 对高龄孕妇和高危妇女进行 PGD 可以有效地避免遗传病患儿的出生。（二） 可以有效地避免传统的产前诊断技术，对异常胚胎进行治疗性流产，
2、避免中期妊娠遗传诊断及终止妊娠所致的危险及痛苦。（三） 技术的产生与完善可以排除遗传病携带者胚胎，阻断致病基因的纵向传递，从而降低人类遗传负荷。三、适应征理论上只要有足够的序列信息，能针对任何遗传条件进行诊断，即凡是能够被诊断的遗传病都可以通过来防止其患儿出生。进行 PGD 的主要对象是可能有遗传异常或高危遗传因素，需要产前诊断的病例，尤其是可能同时具有两种以上不同的遗传异常情况。现已用于一些单基因缺陷的特殊诊断，包括 Duchenne 型肌营养不良、脆性综合征、黑朦性白痴(Tay Sachsdiseade)、囊性纤维病(cysticfibrosis)、Rh 血型、甲型血友病、镰型细胞贫血和地
3、中海贫血、进行性营养不良、新生儿溶血、21 抗蛋白缺乏症， 、粘多糖贮积症( )、韦霍二氏脊髓性肌萎缩(Werding Hoffman disease)，还有染色体异常如DownS 综合征、18 三体，罗氏易位等。四、植入前遗传学诊断的取材可从胚胎着床前各个阶段活检取样，获取其遗传物质信息进行诊断。目前多采用激光打孔、机械切割或 Tyrode 酸化打孔后吸出细胞的方法取材。（一）极体2极体细胞可以使用第一极体或第二极体，它们在胚胎发育和合子形成中是非必须的，因而不影响卵子受精和正常发育，且不会引起伦理学上的争议。极体活检比胚胎活检对胚胎的创伤性小，且不为染色体的嵌合性所影响，可以间接地反映母源
4、性遗传缺陷。但极体活检细胞不能检测父源性非整倍体核型或发生于受精期间及受精后的其它异常，例如多倍体、单倍体及嵌合性，而且只能取到一个细胞核进行分析，结果的可靠性有限。（二） 卵裂球细胞 目前多选在卵裂期，即体外受精 3 天后 610 细胞期进行。取出 1-2 卵裂细胞进行诊断，其它细胞留待诊断后决定取舍。实验证明，从胚胎中活检出 25%的细胞，并不会影响其正常发育;活检成功率可达 97%。胚胎活检可以用于检测母体的非整倍体核型以及父源的非整倍体核型、多倍体、单倍体和广泛的嵌合性，诊断的准确性较高。（三）囊胚滋养层细胞有了囊胚培养后：1）可为植入前诊断提供充足的时间; 2）可活检滋养层细胞用于诊
5、断，不影响胚体的发育，且所能获取的细胞数目相对多些(10 30 个) ，减少嵌合现象干扰。而且此阶段的胚胎基因表达更为完全，增加了诊断的可靠性，是较为理想的 PGD 材料。然而受精卵在体外培养，目前只能有 50%能达到囊胚。使该时期的 PGD 受到了限制。尽管引入了激光活检并改善了囊胚培养方法，许多研究中心仍然选择在胚胎发育的第 3 天进行检查。目前囊胚滋养层细胞活检进行 PGD 还罕见报道。五、主要检测技术单基因病的 PGD 基本上以 PCR 技术为基础。染色体原位杂交(FISH) 技术的引入，扩大了 PGD 的诊断范围，特别是间期核单细胞 FISH 技术的成功，以及多种多样 FISH 探针
6、的开发，把 PGD 扩展到了染色体病的诊断。（一）荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization， FISH）将 DNA 探针用不同颜色荧光染料标记，与固定在玻片上的卵裂球细胞不同染色体杂交后，在荧光显微镜下被杂交的部分呈现不同颜色的荧光,从而对染色体异常进行筛查。通过 FISH 技术采用多种探针可诊断男、女性别和性连锁疾病，也可诊断染色体疾病包括数目和结构的畸变。1、 FISH 简要流程。一般每个卵裂球细胞只能标记 5 条染色体，约需 5 个多小时。1)固定卵裂球细胞于玻片上; 32)细胞裂解;3)脱水; 4)荧光标记探针，并使之与卵裂球染色体杂交; 5)
7、漂洗除去背景染料; 6)加入二氨基苯基吲哚(DAPI)负染(counterstain)，在荧光显微镜下观察。2、 FISH 技术在 PGD 中的应用1） 胚胎性别的鉴定,排除性连锁疾病的发生。对于连锁隐性遗传病 ,通过 FISH 技术鉴定性别,防止后代相应遗传病的发生。2) 染色体疾病包括数目和结构的畸变。3、FISH 技术在的应用中还存在一些亟待解决的问题1)受探针荧光素染料的限制,每个卵裂球只能用 25 个探针分析染色体,限制了染色体数目的分析。2)技术进行时受时间和卵裂球数目的限制,用单卵裂球进行时,3%的卵裂球会没有信号及出现 5%的错误结果。3)技术的实验条件要求较高, 操作过程中的
8、任何一个小的失误均可导致严重的临床后果。采用单细胞快速制备中期染色体的方法，结合多种 FISH 技术，如多重杂交 FISH 技术、光谱核型分析、比较基因组杂交等，大大地提高了 PGD 检测的准确性和有效性。比较基因组杂交(comparative genomic hybridigation,CGH)是一种与 FISH 相关的技术。将来自待测标本的 DNA 用绿色荧光标记，来自原来已测的正常核型的 DNA 用红色荧光标记。这两组 DNA 同时与一个玻片上的正常中期染色体杂交。若样本中无染色体不平衡（如绿色 DNA 与红色 DNA 核型相同） ，两种颜色的 DNA 片段平等地竞争染色体上的杂交位点。
9、红色、绿色 DNA 等量杂交产生黄色，但若测试样本中含有多余的染色体，如 21 三体，这条染色体的绿色 DNA 片段多于红色，这种效果可产生微绿的颜色，相反，若测试样本中染色体缺失，这条染色体的红色 DNA 片段多于绿色，就产生微红的颜色。复杂的计算机分析软件可计算每条染色体全长红：绿的精确比率。CGH 还可测出易位携带者。CGH 应用于 PGD 的主要障碍是 DNA 的量。多数方法要求 100ng-1ugDNA，这是超过10000 个细胞的 DNA 量。PGD 只有 1-2 个细胞，用于 CGH 前需要整个基因组扩增。CGH最近成功地应用在卵裂球检测。4(二) 聚合酶链反应(PCR)技术主要
10、应用于性别和单基因遗传病的诊断。1990 年,Handyside 等采用技术扩增染色体特异重复序列(DYZ),对胚胎进行性别诊断,植入女性胚胎,避免了有高危可能染色体连锁疾病的发生,开创应用于人类的先河,并采用此技术,促使了几个健康女婴的出生。从原理上讲，只要已知某种致病基因，通过合适的引物可将其由单拷贝放大而检测出来。1、PCR 过程(1)扩增染色体特异性序列,根据片段的存在与否判断胚胎性别 ;(2)扩增目的基因后,结合、分子杂交及测序等方法分析扩增产物;(3)采用等位基因特异性(allele specific PCR, ),即将突变的碱基设计在3端的引物和正常序列引物分别在两个扩增体系里进
11、行扩增,也可以将引物标记,混合在一起,然后再在同一扩增体系进行扩增,只有引物与模板互补,才能出现明显扩增带,此法已用于囊性纤维增生症 508 突变的诊断;(4)对基因缺失型遗传病,在缺失的基因序列内设计适宜的引物 ,根据扩增产物存在与否判断该基因是否缺失;(5)对长片段基因缺失的遗传病,如 地中海贫血,在缺失的片段前后设计一引物 ,由于扩增片段长度有限,若扩增后出现扩增带,则诊断为基因缺失。2、存在问题及解决方法（1）现象1991 年和等首先报道了现象,即突变的等位基因可能未扩增出来或含有 2 种不同基因突变的隐性遗传病,只有一种突变扩增出来,从而造成误诊。针对现象,许多学者提出了不少方法:胚
12、胎活检时取 2 个细胞,提高变性温度,使模板尽量完全裂解,还有上述采用的荧光或多重等,将连锁多态标记同时应用于基因突变分析,表明单细胞多重进行诊断可靠性为98%。（2）嵌合型现象及多核细胞现象45,和 47,是女性及男性最常见的染色体畸变之一,因为嵌合体的存在,单纯进行扩增染色体片段可能致假阴性。等报道,15% 质量好的胚胎有 1 个以上多核细胞,2 细胞期多核细胞为67.0%,4 细胞期为 25.0%。若活检的细胞正好是异常的,则可能造成误诊。因此由于受诊断5取材的限制,对单个细胞诊断性别或染色体病时,应考虑嵌合型现象及多核细胞现象所造成的误诊。（3）污染问题由于敏感性高,模板量少(通常为单
13、细胞) 的扩增体系极易污染。试剂和外界环境物质所致的污染可通过严谨的试验操作得以避免。对可能包含精子、颗粒细胞等可经反复清洗活检前胚胎和多次更换吸管得到避免,而且目前采用的方法,此种污染较少发生。母体来源的细胞可用多重或同时检测胎儿及其父母的指纹加以鉴别。六、应用现状1990 年，Handyside 首次报道用 PCR 技术使一对有高风险生育性连锁疾病进行性肌营养不良(DMD)患者的夫妇分娩一名健康女婴。随后，他们又引入巢式 PCR 技术用于单基因病 PGD。1992 年，成功地对囊性纤维化病变(CF)进行了植入前诊断，并分娩了正常婴儿。此后，PGD 在世界范围内蓬勃发展。PGD 婴儿与 IC
14、SI 的婴儿相比，新生儿问题或畸形发生率都不高。与常规 ICSI 分娩的1987 个婴儿的情况非常相似，PGD 分娩的 162 个婴儿中单胎占 54%、双胎 41%、三胎5%。其他指标，如出生体重、身长、头围两组也很相似，主要的异常发生率(2.3%)亦与ICSI 组 2.9%非常接近。七、存在的问题（一）单细胞遗传学分析诊断的准确性和可靠性。（二）的费用较高。（三）伦理、法律和社会学问题。八、展望人类基因组计划研究的进展、DNA 诊断分析技术以及其他技术的不断发展促进了PGD 技术迅猛发展。迄今有 1000 多种遗传病的基因被定位，随着人类基因组计划(human genome program，
15、HGP) 工作的进展，人类所携带的 10 万对基因密码将被破译，为提供直接可靠的依据。人类基因组计划带来的基因组革命与结合，必将使人类在认识自身、防治疾病、自主生命上有一大的飞跃，必将由此而引发人类的一次技术革命。芯片技术是近年来发展起来的新技术，利用此技术可以在基因组水平上进行表达、突变和多态性分析以及遗传制图和序列测定，现已应用于人类疾病的诊断。此技术具有快速、准确、低耗的特点。一次可对上千种基因进行分析，其精细度可达单个细胞单拷6贝。不久，在芯片上对某一患者的全部基因组的遗传分析将成为常规。应该进一步提高 PGD 诊断的准确性和可靠性，以便深入研究与男女不育症相关的染色体异常、可以传给子代的遗传突变以及胚胎遗传异常发生频率较高的染色体，对多基因疾病，例如恶性肿瘤、糖尿病、冠心病等的 PGD 也将成为可能。
