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1、生命科学部部门培训 分子病理诊断技术及应用 李贞lizhen 15110256842 国药集团联合医疗器械有限公司 病理的发展过程 人体 染色体 DNA关系 每个人体细胞内有一个细胞核 每个细胞核内有46条染色体 每个染色体都蕴含着具有遗传效应的DNA片段 正是它们决定了我们每个不同的个体 现在 让我们一起揭开染色体和DNA的结构与功能之谜 PPT模板下载 目录 1 分子病理概述 2 分子病理学实验室设施与环境 3 病理科实验室质量管理标准 4 分子病理学常用检测设备 5 推荐设备型号及预算 6 常用试剂及价格 国药集团联合医疗器械有限公司 7 经济效益分析 分子病理诊断的市场介绍 分子病理诊
2、断的应用范围 常用分子病理诊断技术 分子病理诊断的现在和未来 国外厂家 罗氏诊断 瑞士 Gen Probe Hoiogic 美国 QIAGEN 荷兰 BD 美国 西门子 德国 生物梅里埃 法国 雅培 美国 诺华 瑞士 Cepheid 美国 和贝克曼库尔特 美国 国内厂家 深圳华大 达安基因 科华生物 上海之江 北京博奥 厦门艾德 湖南圣湘 福州泰普 广州安必平 分子病理诊断的应用范围 肿瘤易感基因的检测 Rb1视网膜母细胞瘤 WT1肾母细胞瘤 肿瘤先关病毒的检测 HPV病毒与宫颈癌发生有很大关系 肿瘤的早期诊断 K ras基因突变在结肠癌 胰腺癌 肺癌等肿瘤中发生率高 结肠癌指导靶向用药爱必妥
3、 肺癌指导靶向用药吉非替尼 埃罗替尼 疑难肿瘤的诊断和分类 T细胞受体基因重排具有鉴别淋巴细胞增生和淋巴瘤 Bcr区基因重排可对慢性粒细胞性白血病和急性粒细胞性白血病进行鉴别诊断 N myc和C myc检测可对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤有应用价值 肿瘤的预后监测肿瘤个体化和预见性治疗提供依据肿瘤的预后判断 HER2基因阳性表达表示乳腺癌治疗预后不良需要改变治疗方案 指导靶向用药赫赛汀 常用分子病理诊断技术 免疫组织化学技术 IHC 检测蛋白质分子原位杂交 检测DNA RNA 荧光原位杂交技术 FISH 检测DNA RNA多聚酶链式反应技术 PCR 检测DNA RNA 荧光定量PCR技术 检测
4、DNA RNADNA测序技术 检测DNA突变 生物芯片技术 检测DNA RNA 蛋白质DNA印迹技术 southernblot 检测DNA 微卫星不稳定性检测技术 MSI 分子病理诊断的现在和未来 未来 突破 自动化不足 限制检测通量 检测技术难以突破 产品同质化严重 仪器一体化 自动化 操作简便增强研发能力 革新技术 研发新品二代测序技术突破提升 提高检测速度 降低检测成本 荧光原位杂交技术 FISH 原理 通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交 在荧光显微镜下能原位显示细胞核内杂交信号的分子细胞遗传学技术 步骤 FISH样本制备探针的制备探针标记杂交染色体显带荧光显微镜检测结
5、果分析在医院中的使用 病理科 血液科 妇产科 生殖中心 产前诊断 植入前诊断 产品种类及厂家品牌 细胞类探针 白血病 淋巴瘤 骨髓瘤 产前诊断和产后筛查类实体肿瘤类探针 乳腺癌 子宫颈癌 膀胱癌 肺癌 软组织肉瘤 前列腺瘤 甲状腺癌等方面实验室基本要求 环境 样本准备区 暗室 10 15平米左右 设备 荧光显微镜以及荧光成像分析系统 水浴锅 原位杂交仪 冰箱 离心机 恒温箱办公设备 电脑 打印机实验耗材 FISH探针 普通实验耗材技术人员 1人 实时荧光定量PCR技术 原理 在PCR反应体系中加入荧光基团 通过探针与扩增产物的结合释放出荧光信号 再通过专门的仪器对信号进行实时检测 经过软件分析
6、可以准确计算出目的基因的初始数量 实现定量检测 步骤 提取样本核酸反转录成CDNA设计引物和探针制备探针标记RT PCR反应进行分析荧光实验图应用范围 临床疾病诊断 动物疾病检测 食品安全 科学研究 应用行业检测肿瘤的项目 CEA mRNA AFP mRNA UPA mRNA CK19 mRNA CK20 mRNA MDRI mRNA 优点 特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化 可以在一个试管内将目的基因数小时内扩增至百万倍 可从一根毛发 一滴血 一个细胞内扩增出足量的DNA进行研究和检测鉴定 实验室基本要求 需要避光的暗室 有荧光显微镜观察室技术人员 1人 DNA一代测序技术
7、原理 sanger双脱氧核苷酸末端终止法 利用DNA聚合酶 以待测单链DNA为模板 以dNTP为底物 设立四种相互独立的测序反应体系 在体系中加入不同的ddNTP作为链延伸终止剂 在测序引物指导下 按照碱基配对原则 每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链 通过凝胶电泳后 可以读出新合成链序列 由此推知待测模板链的序列 步骤 测序模板的纯化与定量 测序反应 测序反应产物纯化与变性 上样电泳 分析结果应用范围 寻找与疾病相关的突变信息 指导靶向用药 寻找致病基因 各种基因作用的破解 提高农产品质量 明白个人基因信息 选择投保临床检测项目 K RAS基因突变检测 结直肠癌 胃癌 头颈部癌及肺癌
8、 爱必妥类靶向治疗 EGFR基因突变检测 肺癌 易瑞沙和特罗凯靶向治疗 Bcr Ab1融合基因和C KIT PDGFR基因突变检测 白血病 胃肠道间质瘤 格列卫靶向治疗 乳腺癌化疗 结直肠腺癌化疗的个体化治疗方案技术人员 1 2人 DNA二代测序技术 原理 大规模平行测序法 单链DNA文库被固定在芯片上并带有合成引物 用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP 逐一加入DNA芯片上 当聚合酶合成互补链时 每添加一种dNTP就会释放不同的荧光 根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理 从而获得待测DNA的序列信息 步骤 文库制备DNA芯片创建进行测序数据分析 哪种检测技术才是现在临床使用最广的
9、分子病理学实验室设施与环境 1 布局合理 实验室各区域的正确划分 3 消防设施安全消防通道畅通 4 石蜡组织 DNA样本的存放 2 水电 照明 通风符合实验室基本要求 5 实验室记录 操作手册等文件存放 7 安装生物安全防护措施 8 实验室的清洁日常消毒 有相关记录 6 实验室耗材试剂的存放废弃物的处理 病理科实验室质量管理标准 卫生部 2009 31号文件 病理科建设与管理指南 2006年6月1日实施的 医疗机构临床实验室管理办法 全国各省市的关于临床病理专业质量检查及评价标准美国CAP认可标准欧洲NordiQC认证标准国际标准化组织制定并与2003年正式发布医学实验室的管理标准 ISO15
10、189 2003 医学实验室质量和能力的专用要求 IHC ISH 分子病理学实验室检测设备 免疫组化染色 所需试剂 机用缓冲液机用清洗液机用抗原修复液一抗试剂机用二抗检测系统 分子病理学实验室检测设备 原位杂交 所需试剂 原位杂交试剂盒二甲苯无水乙醇PBS清洗液 分子病理学实验室检测设备 荧光原位杂交 FISH HyChrome是一个创新产品 用于完成高温原位变性和退火杂交探针过程 HyChrome由一个单独的平板加热模块和一个湿度箱组成 平板加热模块的温度是由一个数字微处理器来控制 湿度箱为了减少脱水 最终实现高信号和低背景杂交 在一个模块中完成标本变性和杂交的温度控制技术以及可能性已被验证
11、了 该技术以及可能性保证了片子之间温度的可变性和一个好的再现性 所需试剂 一抗探针二抗试剂蛋白酶变性液二甲苯无水乙醇PBS清洗液 分子病理学实验室检测设备 DM2500 荧光显微镜部分数码成像系统部分细胞染色体核型分析软件荧光原位杂交分析软件 荧光定量PCR仪 显示器 核酸电泳仪 椅子 空气流向 扩增和分析区 金属浴 水槽 离心机 生物安全柜 冰箱 椅子 空气流向 样本制备区 废液缸 振荡器 天平 离心机 椅子 试剂准备区 空气流向 专用走廊 普通PCR仪 凝胶成像系统 核酸提取仪 DNA测序仪 分子病理学实验室检测设备 核酸提纯仪 博日GenePure核酸提纯仪采用磁珠分离技术 提取过程自动
12、化多选择性试剂盒可以从多种样品材料中分离纯化高纯度的核酸省时 省力 高效 准确 分子病理学实验室检测设备 PCR扩增仪 博日GeneMax 所需试剂 PCRMIX引物双蒸水 分子病理学实验室检测设备 生物安全柜 高效循环空气过滤器自适应压力调整功能微机控制大屏幕液晶显示配重前窗环境安全配备有紫外灯照明系统 分子病理学实验室检测设备 离心机 产品特征 适应于DNA的分离 提纯及后处理清洁工作最大转速达15000rpm无需手动 自动关门运行安静 无碳刷感应电机温度范围 从 20度到40度 保证样品的生物活性适用于0 25ml到500ml的样品运行时间 9h59min 连续离心 贝克曼Allegra
13、25R台式高速冷冻离心机 分子病理学实验室检测设备 荧光定量PCR仪 采用荧光实时检测方式 实现在同一管内同时进行扩增和检测 无须后处理先进的热电制冷技术 保证了超高速的热循环系统加热 制冷迅速 稳定稳定 准确的1 36 梯度功能 确保PCR条件更优化 SOAK的恒温功能 实现了PCR试剂的低温保存l对PCR扩增全过程进行实时动态监测线型范围大 可达到10个数量级的起始DNA拷贝数无需梯度稀释无需开启PCR反应管 可避免在PCR期间及PCR之后产物污染 确保结果准确多色荧光检测 在单一反应中取得更多信息自动化的热盖技术 无需手动开 闭 保证热盖在不同高度试管使用时的压力可打印多个或单个样本先进
14、的模块底部荧光检测技术 受发明专利保护l支持RS232 USB Bluetooth接口 博日LineGene9600 所需试剂 待测样本核酸提取试剂盒待测样本浓度测定逆转录试剂盒荧光定量PCR试剂盒其他试剂 分子病理学实验室检测设备 ABIStepOnepPlus 荧光定量PCR仪 性价比极高的三色 48孔 StepOne 或四色 96孔 StepOnePlus 系统基于使用寿命长的LED的光学系统 可以检测多种荧光染料 用于基因表达分析 病原体定量检测 SNP 单核苷酸多态性 基因分型 以及阴性 阳性分析等多种实验可以进行标准模式和快速模式PCR反应 快速模式可以在40分钟内完成PCR反应L
15、CD触摸屏和支持USB存储 使得系统配置更灵活 并且可以实现无PC操作具有独特的VeriFlexTM加热块 极大地提高了系统的功能和温控的精度 分子病理学实验室检测设备 核酸电泳仪 外形尺寸 L W H 242 132 105mm凝胶板规格 L W 85 80mm试样格 12 15齿 1 0 2 0mm厚重量 约1Kg缓冲液总容量 约500m适用于鉴定 分离 制备DNA以及测定其分子量 有冷却装置 可做双排胶 此型号适用PCR电泳或RNA电泳 北京六一电泳仪 分子病理学实验室检测设备 核酸凝胶成像系统 暗箱式 无需暗室 可全天候使用抽屉式灯箱互换 使用方便 防止污染具有实时预览 自动对焦功能紫
16、外滤光镜 EB专用超多层镀膜滤光镜 M52 0 75 兼容tif jpg bmp gif等诸多图像格式高清晰度130万像素摄像头 高品质成像质量 遥控电动变焦 智能化控制专用拍摄软件与分析软件一体操作 使 观察 拍摄 分析一气呵成通过USB接口与计算机连接 不触动计算机内部硬件 便于维护和保修紫外 白光转换屏 用途 主要用于核酸 蛋白质电泳观察 照像和实验结果科学分析 分子病理学实验室检测设备 DNA一代测序仪 ABI3730XL sanger法 毛细管电泳分离 电脑荧光检测 数据分析可得到DNA碱基序列 性能特点 毛细管规格 96道毛细管毛细管长度 50cm凝胶的规格 POP 7液体分离胶配套的试剂 基因测序 BigDye3 1v和5 Sequencebuffer 基因分型 Liz120 Liz500 ROX500 基因测序及分型的运行时间时间 96样本 2h通量 94 96 384 12优点 方法可靠 准确度高 且已形成规模化缺点 测定通量低 成本高读长 700 900bp 分子病理学实验室检测设备 DNA二代测序仪 IlluminaGA 循环芯片技术 技术特点 测序通量高 每个测
