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1、1胎盘贴壁细胞的生物学特性【关键词】 胎盘；贴壁细胞；干细胞Biological characteristics of placentaderived adherent cells【Abstract】 AIM: To isolate and culture human placentaderived adherent cells (hPDAC) in vitro and study their biological characteristics involving morphology, phenotype and differentiation. METHODS: Mononuclear
2、cells were harvested after placenta tissue was digested by collagenase IV, seeded and cultured in lowglucose DMEM containing 100 mL/L FBS. Their surface markers were detected by flow cytometry; the growth curve was made; cells of 3 passages were induced to differentiate into osteoblasts with vitamin
3、 C, dexamethasone and sodium glycerophosphate, and the induced cells were observed in the change of matrix mineralization with alizarin red staining; cells of 3 passages were induced to differentiate into lipocytes with dexamethasone and insulin, and the induced cells were observed with oil red O st
4、aining. RESULTS: By day 27-14, a few of adherent cells were observed and expanded the same as fibroblasts, and adherent cells were positive for CD29, CD44 and CD105, but negative for CD34, CD45, CD19. After 10day induction, alizarin red staining showed the calcium mineralization and after 7 d, oil r
5、ed O staining revealed the appearance of fat drops. CONCLUSION: The hPDAC was confirmed to have the osteogenic and adipogenic potentials, indicating that they could be regarded as an alternative source of stem cells.【Keywords】 placenta; adherent cells; stem cells【摘要】 目的： 通过体外分离和培养胎盘贴壁细胞，以研究其形态、表型和分化
6、特点. 方法： 采用 IV 型胶原酶消化人胎盘组织，获得单个核细胞，接种于 100 mL/L FBS 低糖 DMEM 培养基中，贴壁后常规换液、传代，流式细胞仪检测其表面标志，绘制生长曲线. 采用 甘油磷酸钠、维生素 C、地塞米松联合诱导，使胎盘贴壁细胞分化为成骨细胞，诱导后 10 d 行茜素红染色；采用地塞米松、胰岛素诱导，使胎盘贴壁细胞分化为脂肪细胞，油红 O 染色鉴定. 结果： 培养 714 d 后有少量贴壁细胞生长，逐渐呈成纤维细胞状，表达 CD29，CD44 和 CD105，不表达CD34，CD45，CD19；在成骨诱导 10 d 后细胞茜素红染色可见钙3盐沉积，成脂肪诱导 7 d
7、后油红 O 染色见脂肪滴形成. 结论： 通过不同方式诱导培养，胎盘贴壁细胞可分化为成骨细胞及脂肪细胞，提示胎盘贴壁细胞可能是新的干细胞来源.【关键词】 胎盘；贴壁细胞；干细胞0 引言间充质干细胞（marrow stromal cell, MSC）主要来源于骨髓，可以分化为多种组织细胞：成骨、软骨、脂肪、神经细胞等，但随着年龄增长或合并感染、肿瘤等疾病时骨髓干细胞的分化能力明显下降，因此寻找新的干细胞成为当务之急. 近几年来有学者发现胎盘组织中存在 MSC. 为进一步证实这一发现，我们从胎盘中提取贴壁细胞，观察其生物学特性，以探讨其是否具有干细胞特性.1 材料和方法1.1 材料足月剖宫产的胎盘（
8、产妇同意） ，低糖DMEM（Gibco 公司） ，新生牛血清（FBS，Gibco 公司） ，IV 型胶原酶（Sigma 公司） ，胰蛋白酶（Sigma 公司） ，鼠抗人单克隆抗体CD19，CD44，CD45，CD105，CD34， CD29（晶美公司） ，茜素红（Sigma ） ，油红 O（Sigma） ，倒置显微镜（Olympas） ，4CO2 培养箱（Jouan ） . 1.2 方法 1.2.1 胎盘贴壁细胞的分离和培养取足月剖宫产胎盘，剪取胎儿侧胎盘组织，PBS 反复冲洗，剪成碎块，以 1 g/L IV 型胶原酶37消化 30 min，取上清液，以 800 r/min 离心 5 min，
9、沉淀物重复消化，收集每次离心后的细胞沉淀，PBS 冲洗 2 遍，以1107/L 的密度接种于 100 mL/L FBS DMEM 培养基中，贴壁后35 d 换液 1 次，取传 3 代以上细胞备用.1.2.2 胎盘贴壁细胞的表型测定取第 3 代细胞，以 2.5 g/L 胰蛋白酶消化 3 min，100 mL/L FBS 终止消化，PBS 冲洗 2 遍，调整细胞数为 1104/L，分别加入鼠抗人单克隆抗体 CD19, CD44, CD45, CD105, CD34，流式细胞仪检测细胞表型.1.2.3 生长曲线的绘制取第 3 代细胞，以 2107/L 的密度接种于 12 孔板中，每日取 3 复孔，台
10、盼蓝染色计数活细胞，连续培养计数 7 d，计算平均值，绘制生长曲线.1.2.4 细胞周期测定取第 3 代细胞，以 2.5 g/L 胰蛋白酶消化3 min，10 mol/L FBS 终止消化，PBS 冲洗 2 遍，调整细胞数为51106/L，流式细胞仪检测细胞周期.1.2.5 细胞诱导分化及染色取第 3 代胎盘细胞，以 2.5 g/L 胰蛋白酶消化 3 min, 10 mol/L FBS 终止消化，800 r/min 离心 5 min，PBS 冲洗 3 遍，分为 4 组分别以 1105/L 细胞数接种于 6孔板中，1 组加入成骨诱导剂（ 20 mmol/L 甘油磷酸钠、50 mg/L 维生素 C
11、，10 mmol/L 地塞米松，100 mL/L 新生牛血清DMEM 培养基） ，2 组加入脂肪诱导剂（10 mmol/L 地塞米松、10 mg/L 胰岛素、100 mL/L 新生牛血清 DMEM 培养基） ，3,4 组为对照组，采用 100 mL/L 新生牛血清 DMEM 培养基培养，置 37 ，50 mL/L CO2 孵箱培养，每 35 日换液 1 次. 取培养 10 d 后的1，3 组细胞，倒掉培养液，多聚甲醛固定 30 min，PBS 冲洗 3 遍，茜素红染色 8 h，显微镜下观察阳性结果. 取培养 7 d 后的 2，4 组细胞，多聚甲醛固定后油红 O 染色.2 结果2.1 胎盘细胞的
12、原代培养消化胎盘组织获得少量的单个核细胞，约 714 d 后贴壁，从不规则形，逐渐变为梭形，呈漩涡状生长，约 4 wk 后长满瓶底，胞体呈细长，形态类似成纤维细胞（图2） ，1 wk 左右传代 1 次，可稳定传至 10 代. 流式细胞仪检测显示低表达 CD29，高表达 CD44 和 CD105，不表达 CD34，CD45 和CD19. 细胞的对数生长期约在第 24 日，其倍增时间为 39 h（图61）. 流式细胞仪检测发现 G0/G1，S ，G2/M 期的比例分别为20.15%, 72.54%和 6.89%.图 1 胎盘贴壁细胞生长曲线（略）2.2 胎盘细胞的诱导分化成骨诱导组细胞在诱导 10
13、 d 时可见细胞呈漩涡状重叠生长，并聚集成团，茜素红染色可见多个散在分布大小、形态各异的不透明棕红色钙化结节. 对照组少见钙化结节（图 3）. 成脂肪诱导组细胞在诱导 7 d 时油红 O 染色可见细胞中出现多个染色深红的脂肪滴，而对照组中则偶见脂肪滴（图 4）.A： 培养 10 d；B： 培养 28 d.图 2 胎盘原代细胞100（略）A：诱导组; B：对照组.图 3 成骨细胞茜素红染色 100（略）A：诱导组；B：对照组.图 4 成脂细胞油红 O 染色 100（略）73 讨论早在 2000 年即有学者从冻存的胎盘组织中分离培养出贴壁细胞1 ，但胎盘间充质干细胞（ MSC）的研究尚处于起步阶段
14、 . 我们从形态学、免疫学及分化能力等方面加以研究进一步证实胎盘贴壁细胞的生物学特性. 一般认为大多数 MSC 培养时贴壁，呈成纤维细胞状，因而采用贴壁法获得 MSC 的研究较多2 . 胎盘是实体组织，富含血管和间充质成分，我们采用酶消化法，获取细胞沉淀进行培养，与骨髓贴壁细胞相比较，其贴壁时间较长（12 wk） ，骨髓为 72 h3 ，并且胎盘贴壁细胞需 28 d 左右才能铺满瓶底. 骨髓贴壁细胞大多最初为梭形，7 d 左右形成小集落，其后迅速生长，变为均一的长梭形3 ，与胎盘贴壁细胞相似 . 另外我们的实验检测到的胎盘贴壁细胞的倍增时间为 39 h，文献中为 37 h4 ；我们检测细胞周期
15、显示细胞大部分处于分裂期，而以往的报道发现细胞大部分处于静息期4 ，因而胎盘贴壁细胞的特性尚需进一步研究.目前对于胎盘贴壁细胞的免疫学特点尚无统一的认识，我们的研究发现胎盘贴壁细胞的表型与骨髓 MSC 相似5-6 ，表达CD29, CD44 和 CD105，不表达 CD34, CD45, CD19, CD44, CD29 均为黏附分子，是纤连蛋白和透明质酸盐的受体，在基质细8胞中表达较多，这样的结果使我们推测培养的胎盘贴壁细胞中可能包含大量的能表达基质细胞标志的细胞，即 MSC，但仅凭细胞形态和少量的表面标志尚不能完全说明贴壁细胞即为 MSC，MSC 的最重要特性应该是多向分化潜能.如果胎盘贴
16、壁细胞中含有 MSC，理论上讲 MSC 来源于中胚层，具有向中胚层组织及神经外胚层组织分化的能力7-8. 我们的实验证明 甘油磷酸钠和低浓度的地塞米松联合诱导后细胞中钙盐沉积，茜素红染色显示产生大量钙化结节，说明其有成骨能力，只有干细胞才具有这种能力. 在诱导体系中维生素 C 可以促进体外培养细胞合成胶原，形成钙化，能调节 ATP 及 ALP 活性，并影响其合成， 甘油磷酸钠可以提供磷离子作为 ALP 的底物，地塞米松可以增强 ALP 活性. 而 ALP 可以破坏钙化抑制剂，启动钙化8形成钙盐，茜素红特异性结合钙剂，阳性表现为棕红色，钙的含量愈高染色愈深，是鉴定成骨细胞特性的特异性指标. 我们的实验由于条件限制，只是初步观察胎盘贴壁细胞的特点，证明其具有干细胞特性，但尚有许多问题如培养的条件、促进生长的因子、传代后是否逐渐衰老、诱导后移植的效果等等，需更深入的研究. 我们的研究提示胎盘贴壁细胞的分离培养具有潜在的临
