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1、1肾缺血预处理对兔未成熟心肌 Bcl作者：孙忠东，高尚志，池一凡，夏家红，杨辰垣 【关键词】 缺血预处理Effects of renal ischemic preconditioning on the expressions of Bcl2, Bax, Fas proteins in immature myocardial cells in rabbits【Abstract】 AIM: To investigate the effects of renal ischemic preconditioning (RIP) on apoptosis and expressions of Bcl2,
2、Bax and Fas proteins in immature myocardial cells in rabbits. METHODS: Isolated working rabbit heart model was used in this study and 24 immature rabbits were randomly divided into control group, ischemia/reperfusion (I/R) group and RIP group. The TUNEL, nucleosomal ladder of DNA fragments and the e
3、xpression of Bcl2, Bax and Fas proteins were detected. RESULTS: Compared with that in I/R group, TUNEL cell apoptosis was lower (4.191.13)% vs (12.302.10)%, P0.01, ladder of DNA fragments was lower (57 3501765 vs 135 2003370, P0.01), Bcl2 2expression was higher (33 5251026 vs 12 385860, P0.01), Bax
4、expression was lower (8640768 vs 32 4721128, P0.01) and Fas expression was lower (8936912 vs 32 1001260, P0.01) in RIP group. CONCLUSION: RIP decreases immature myocardial cell apoptosis and affects the expressions of Bcl2, Bax and Fas proteins.【Keywords】 kidney; ischemic preconditioning; apoptosis;
5、 Bcl2; Bax; Fas【摘要】 目的： 探讨肾缺血预处理(RIP)对兔未成熟心肌细胞凋亡和 Bcl2, Bax, Fas 蛋白表达的影响. 方法： 24 只幼兔采用Langendorff 离体心脏灌注模型，随机分为正常对照组（C） 、心脏缺血/再灌注组(I/R)和肾缺血预处理组(RIP)，每组 8 只，测定各组未成熟心肌细胞凋亡和 Bcl2, Bax, Fas 蛋白表达. 结果： RIP 组与I/R 组比较，心肌细胞凋亡率明显减少(4.191.13)% vs （12.302.10）%, P0.01 ，DNA 片段梯光密度明显减少 (57 3501765 vs 135 2003370,
6、P0.01), Bcl2 表达增多(33 5251026 vs 12 385860, P0.01), Bax(8640768 vs 32 4721128, P0.01)和 Fas(8936912 vs 32 1001260, P0.01)表达明显减少 . 结论： RIP 可减少缺血再灌注后兔未成3熟心肌细胞凋亡和影响 Bcl2, Bax, Fas 蛋白的表达 .【关键词】 肾；缺血预处理；细胞凋亡；Bcl2；Bax；Fas0 引言实验表明，成熟心肌和心肌外的组织器官缺血预处理可减少心肌细胞凋亡的发生，其中 Bcl2, Bax, Fas 等基因蛋白的表达在细胞凋亡中起重要作用. 肾缺血预处理 (
7、renal ischemic preconditioning ,RIP)对未成熟心肌细胞凋亡是否有影响的报道甚少. 本实验目的是观察 RIP 对兔未成熟心肌细胞凋亡和 Bcl2, Bax, Fas 等基因蛋白表达的影响.1 材料和方法1.1 材料出生 1421 d 的健康长耳大白兔 24 只(华中科技大学同济医学院动物室提供)，雌雄不拘. MPIAS1000 型多媒体病理图像分析系统（华中科技大学同济医学院清平影像工程公司生产）进行光密度测定. 细胞凋亡试剂盒购自南京建成生物技术有限公司.41.2 方法1.2.1 模型建立及分组按处理方式不同将动物随机分为 3 组,每组 8 只. 开胸，右心耳
8、注入肝素 (300 U/kg)，切开主动脉插入灌注管，即行 KH 液 Langendorff 灌流，灌注压为 6 kPa(45.0 mmHg). 切取心脏，结扎肺静脉，剪开左心耳将内径 3 mm 左房灌注管插入左房，内径 1 mm 测压管插入左心室. 左房灌注压为 1 kPa (7.5 mmHg)，左心后负荷为 3.0 kPa (22.5 mmHg). KH 缓冲液成分(mmol/L): NaCl 118.50, KCl 4.70, CaCl2 2.50, MgSO4 1.20, NaHCO3 25.00, KH2PO4 1.20, Glucose 11.10, Na2EDTA 0.50. 使
9、用时新鲜配制，经 0.45 m滤器过滤，灌流前给予体积分数为 950 mL/L O2 和 50 mL/L CO2 混合气体按 1.5 L/min 向储液瓶内的灌流液中通气 30 min，灌流液维持在 37 ，pH 为 7.4，渗透压为 824850 kPa/L 320330 mosm/L, 1 mosm=2.5787 kPa(37). 正常对照组（ C）: 仅灌注 KH 液 180 min，然后取心肌标本. 缺血 /再灌注组(I/R)： 灌注 20 min 后，停灌 45 min，复灌 120 min. 肾缺血预处理组 (RIP)： 反复 2 次阻断肾血流 5 min/放开 5 min，建立
10、Langendorff 模型，然后重复 I/R 组缺血/再灌注方法.1.2.2 观察指标 凋亡细胞原位标记与半定量分析： 左心室心肌组织常规石蜡包埋，采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT 酶)介导5带荧光的 deuridine triphosphate(dUTP)缺口末端标记法(terminal transferase UTP nick end labeling, TUNEL)1 ，标记凋亡细胞核中 DNA3OH末端，经脱蜡，洗脱，消化，孵育，洗脱， 二氨基联苯胺(DAB) 显色，镜下观察 . 根据凋亡阳性细胞分布情况，每张切片拍摄 5 个阳性视野，每视野计数 300 个心肌细胞中阳性细胞数，以平
11、均计算阳性细胞所占的百分比作为凋亡细胞阳性指数(AI). 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 片段梯： 采用快速法检测DNA 片段梯 2. Bcl2, Bax, Fas 基因蛋白的表达： 采用Western Blot 法. 用 2SDS 样品缓冲液裂解细胞，收集细胞蛋白质，经 SDSPAGE 分离后迅速转移至尼龙膜，按文献3法加入单抗(11000) 及碱性磷酸酶偶联的抗小鼠 IgG(11000)用BCIP/NBT 显色. 应用 MPIAS1000 型多媒体彩色病理图像分析系统进行定量测定 A 值.统计学处理： 数据以 xs 表示，采用 t 检验，P0.05 为差异有统计学意义.2 结果2.1 凋亡细胞
12、原位标记与半定量分析 RIP 组的细胞凋亡率为(4.191.13)%，与 I/R 组的(12.302.10)%比较 P0.01 (Fig 1).62.2 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 片段梯 DNA 片段梯光密度测定 RIP 组(57 3501765)与 I/R 组(135 2003370)比较差异有统计学意义(P0.01).2.3Bcl2, Bax, Fas 蛋白的表达密度测定 Bcl2 蛋白 RIP 组(33 5251026)与 I/R 组(12 385860)比较差异有统计学意义(P0.01)；Bax 蛋白 RIP 组(8640768)与 I/R 组(32 4721128)比较差异有统计学
13、意义(P0.01)；Fas 蛋白 RIP 组(8936912)与I/R 组(32 1001260)比较差异有统计学意义(P0.01 ).3 讨论缺血再灌注损伤可诱发细胞凋亡的发生4 ，细胞凋亡已成为再灌注损伤发病机制中一个重要环节. 通过干预凋亡基因的表达阻断细胞凋亡以减轻再灌注损伤的研究是近年来细胞分子生物学研究的重点之一.近年来研究认为心肌缺血预处理可减少细胞凋亡的发生5. 心肌缺血预处理是通过 PKC 的信号传递来保护心肌的，PKC和 mitoKATP 与凋亡信号转导途径相关连，从而影响心肌的细胞凋亡6 ，而 RIP 的心肌保护作用亦与 PKC 和 mitoKATP 相关. Bcl2主要
14、表达于线粒体外膜、核膜和内质网膜上，其表达可抑制细胞凋7亡，Bax 表达则促进细胞凋亡. 细胞凋亡是一种受促凋亡基因如 fas和抗凋亡基因如 bcl2 调控的主动性细胞死亡过程. Fas 属于 TNF 受体家族. 由 Fas 介导的细胞凋亡存在于多种细胞系中. 心肌细胞膜表达功能性的 Fas 和 FasL，但是在正常情况下 Fas 和 FasL 并不介导心肌细胞发生凋亡.我们通过建立 Langendorff 灌注模型检验了 RIP 对兔未成熟心肌细胞凋亡及 Bcl2, Bax, Fas 基因蛋白表达的影响, 发现 RIP 使缺血再灌注后兔未成熟心肌细胞凋亡明显减少，Bcl2 基因蛋白的表达明显
15、增多，而 Bax, Fas 基因蛋白的表达明显减少，说明在兔未成熟心肌，RIP 可通过影响 Bcl2, Bax, Fas 基因蛋白的表达而减少心肌细胞凋亡.【参考文献】1 Gavrieli Y, Sherman Y, BenSasson SA. Indentification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation J. J Cell Biol, 1992;119:493- 501.2 姜泊. 分子生物学常用实验方法M. 北京： 人民军医出版社，1996：177.83
16、 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manualM. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory. 1989:1860-1874.4 Gottlieb RA, Burleson KO, Kloner RA, et al. Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes J. J Clin Invest, 1994;94:1621-1628.5 Wang NP, Bufkin BL, Nakamura M, et al. Ischemic precondition
