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1、1 1 3 D 葡聚糖检验与临床 天津医科大学总医院胡志东E mail huzhidong27 2 侵袭性真菌感染率上升 3 严重真菌感染迅速上升势头 危重病人的存活期延长 延长了真菌感染的高危期 使此类患者业已增加的人数进一步扩大 医学和相关科学的进步 是日益严重的威胁 4 真菌感染的危险因素 中心静脉插管尿道插管广谱抗生素气管插管腹部外科肠胃外营养营养不良住院时间 感染之前定殖 5 侵袭性真菌感染 条件致病性真菌念珠菌病曲霉病隐球菌病其他 6 诊断方法 影像学组织病理学 细胞学培养血清学分子生物学方法 PlateliaAspergillusELISAFungitellassayPCR un
2、available 传统的方法 7 真菌病实验室诊断主要内容 准确 快速检出真菌病原体真菌镜检真菌培养组织病理生理生化血清学方法分子生物学 8 镜检和培养方法 敏感性低血培养 在肿瘤和血液病病人中 50 尸检证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性 培养结果阳性仅表示存在某种真菌 区分定植和感染困难培养时间长有些标本采集困难 9 非培养方法优点 快速报告结果敏感性提高取材简便多以真菌在致病状态产生的物质为检测标志物 结果阳性提示有致病性定量检测可判断感染严重程度及疗效评估 10 非培养诊断的方法简介 真菌细胞壁成分 1 3 D 葡聚糖检测 G试验 真菌抗原检查半乳甘露聚糖 galactomannan
3、 抗原 GM 甘露聚糖 mannan 抗原隐球菌荚膜多糖抗原 乳胶凝集试验 真菌特异的代谢产物D 阿拉伯糖醇真菌DNA的检测 11 临床诊断 拟诊的微生物学 1合格痰标本直接镜检发现菌丝 且连续培养 2次分离到同种真菌2BALF经直接镜检发现菌丝真菌培养阳性3痰液或BALF直接镜检发现新生隐球菌4乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性5G实验连续两次阳性6GM实验连续两次阳性 12 侵袭性真菌感染的诊断标准EORTC MSG2008修订版 宿主因素临床特征病原学真菌镜检真菌培养组织病理学检查血清学检查方法 间接证据 CSF隐球菌抗原阳性 确诊GM test G test 临床诊断 Clinica
4、lInfectiousDiseases2008 46 13 1 3 D 葡聚糖检测 14 1 3 真菌细胞膜 壁结构 羊毛固醇C 14去甲基化酶14位还原和7 8位异构酶角鲨烯环氧化酶 15 1 3 D 葡聚糖结构 葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中1 3 D 葡聚糖占真菌壁成分50 以上 是真菌细胞壁上的特有成分以1 3 糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链以分支状1 6 D葡萄糖残基作为侧链 16 1 3 D 葡聚糖特性 对热极为稳定 高压121 并不能使其灭活 在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含量较多 对G实验灵敏 当真菌进入人体血液或深部组织后 经吞噬细胞的吞噬 消化等处理后 1 3 D 葡聚糖可从胞
5、壁中释放出来 从而使血液及其它体液中含量增高 当真菌在体内含量减少时 机体免疫系统可将其清除 在浅部真菌感染中 1 3 D 葡聚糖未被释放出来 故其在体液中的量不增高 可用于检测念珠菌 毛孢子菌 曲霉菌 镰刀菌 卡氏肺孢子菌不可检测隐球菌 接合菌 根霉 毛霉等 17 G 试验缘何而来 18 比浊法反应机理 细菌内毒素 1 3 D GlucanLAL RM 反应物 因子C活化因子C因子B活化因子B活化因子G因子G凝固酶原凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白 凝胶 定量浊度仪TurbidimetrictechniqueGEL 19 分析前注意事项 采用无热原采血管抽血后2h内送检血标本4 8 最多存放48h检
6、测环境应保持清洁 20 1 3 D 葡聚糖相关影响因素 以下情况可出现假阳性 使用纤维素膜进行血透 标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料 静脉输注免疫球蛋白 白蛋白 凝血因子或血液制品 链球菌血症 操作者处理标本时存在污染 使用多糖类抗癌药物 放化疗造成的粘膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也可能造成假阳性 21 1 3 D 葡聚糖检测临床价值 早期诊断 侵袭性真菌感染增多且复杂 早期症状无特异性 往往被原发病掩盖 病程长 发现较晚 死亡率高 因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断 指导用药 快速确定真菌感染后 选择好治疗方案 有针对性使用抗真菌类药物 为临床
7、选用副作用小 疗效高 价格适宜的药物提供准确的依据 评价效果 应用抗真菌药物后 定期检测血浆中葡聚糖浓度变化 评价选用药物的有效性 监护病程 监护深部真菌感染易感人群的病发状态 动态观察 易感人群 监测临床疗效 22 曲霉菌半乳甘露聚糖 GM Figure1 10Noncompetitivesandwichmethodofimmunoassay 23 中性粒细胞减少症患者40例 发展为曲霉菌病的高危人群 该研究选择1 3 D 葡聚糖 BG 和半乳甘露聚糖 GM 两个指标用于监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病患者BG和GM两项指标均可用于指导临床诊断和治疗真菌性疾病 但BG可早于GM升高 BG和G
8、M联合检测用于曲霉菌病的诊疗 其特异性和阳性率均为100 例1 CarmenPazos JosePonton etc JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY Jan 2005 结论 BG和GM联合检测有助于临床鉴定血液病患者是否合并真菌感染 并将单一试验假阳性给诊疗带来的影响降低到最小 1 3 D 葡聚糖与循环半乳甘露聚糖的检测比较 用于治疗和监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病 24 不同患者BG andGM 体液变化情况 侵袭性曲霉菌病合并急性髓样白血病患者给予两性霉素B和卡泊芬净用药治疗过程中BG和GM变化情况 25 b 侵袭性曲霉病合并慢性淋巴细胞白血病患者未使用两性霉
9、素B治疗BG 和GM 变化情况 26 c 多发性骨髓瘤患者 非侵袭性曲霉病 BG结果假阳性BG 和GM 27 d Hodgkin s淋巴瘤 非侵袭性曲霉病 患者GM结果假阳性BG 和GM 28 e 急性髓样白血病患者 非侵袭性曲霉病 白色念珠菌和光滑念珠菌培养阳性BG和GM结果假阴性BG 和GM 29 f 慢性淋巴细胞白血病患者 非侵袭性曲霉病 白色念珠菌培养阳性BG和GM结果阴性BG 和GM 30 120名儿童7月 8岁1 3 D 葡聚糖定量检测结果 中位数32pg ml平均值68 128pg ml高值5例12岁348pg ml2岁374pg ml14岁491pg ml13岁754pg ml
10、14岁947pg ml94例 78 180pg ml 例2 P BrianSmith DanielK Benjamin Jr etc CLINICALANDVACCINEIMMUNOLOGY July2007 结论研究数据显示 健康儿童的1 3 D 葡聚糖水平高于健康成人 该指标用于儿童感染性疾病的诊断应慎重 1 3 D 葡聚糖在儿童群体的正常值区间有待进一步研究 儿童1 3 D 葡聚糖水平研究 31 非免疫功能低下儿童1 3 D 葡聚糖水平 32 收集患者82例侵袭性真菌感染组22例其他真菌感染组镰刀菌 接合菌 丝孢菌感染17例念珠菌感染23例对照组 血液肿瘤患者非真菌感染 20例414份血
11、清标本检测GM409份血清标本检测BG侵袭性曲霉菌病患者在留取血清标本前已接受抗真菌药物治疗 包括聚烯类 氮杂茂类 棘球白素类等 半乳甘露聚糖和1 3 D 葡聚糖用于诊断血液肿瘤患者烟曲霉菌感染敏感性较低 R Y Hachem D P Kontoyiannis etc JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY Jan 2009 结论对于血液肿瘤患者合并侵袭性真菌感染的诊断 BG的敏感度优于GM 例3 33 侵袭性真菌感染或者GM和BG检测结果比较 34 例4 1 3 D 葡聚糖和抗白色念珠菌细胞壁抗原的IgG亚型抗体用于系统性念珠菌感染诊疗 系统性念珠菌病患者IgG亚型体液水
12、平升高抗细胞壁碎片IgG1抗体 IgG1 CW 抗磷酸肽甘露聚糖片段IgG2抗体 IgG2 PPM 系统性念珠菌病患者IgG1 CW IgG2 PPM比值升高 结论1 3 D 葡聚糖以及IgG1 CW IgG2 PPM可用于早期诊断系统性念珠菌病 1 3 D 葡聚糖与IgG亚型相结合检测可提高阳性预测值 有效指导早期抗真菌药物治疗 N Kondori L Edebo etc CLINICALANDDIAGNOSTICLABORATORYIMMUNOLOGY Mar 2004 35 念珠菌感染患者14例1 3 D 葡聚糖结果阳性 系统性念珠菌病患者14例1 3 D 葡聚糖检测结果均大于20pg
13、ml 36 血浆1 3 D葡聚糖检测对血液病患者侵袭性真菌感染的诊断价值 本研究收集疑为IFI的血液病患者血浆标本162例 其中化疗后患者85例 造血干细胞移植后患者77例 按照欧洲癌症研究治疗组织及真菌研究组 EORTC MSG 诊断标准 所有病例中有确定诊断2例 临床诊断18例 拟诊75例 排除诊断67例 结果表明 以20ng ml为诊断界值 G试验的敏感性 特异性 阳性预测值 PPV 和阴性预测值 NPV 分别为75 91 72 4 和92 4 在75例拟诊病例中 其中有51例G试验阳性 且对广谱抗生素无效而经过抗真菌治疗有效 经过临床回顾性分析符合IFI 表明G试验使IFI诊断率提高3
14、1 4 例5 刘芳 吴彤 等 中国实验血液学杂志JournalofExperimentalHematology2009 37 G试验对IFI诊断率的影响在所有162例患者中 若无G试验作为诊断标准 仅20例患者达到确诊 临床诊断真菌感染标准 占总病例数12 3 若将G试验阳性作为微生物学标准 则有71例达确诊 临床诊断标准 占总病例数的43 8 在75例拟诊病例中 其中51例真菌培养阴性而G试验阳性的患者 均对广谱抗生素无效而经过抗真菌治疗病情好转 经过临床回顾性分析符合IFI 故G试验使IFI诊断率提高了31 4 38 血浆1 3 D葡聚糖对深部真菌感染诊断的研究 例6 赵勇 王红 等 中国
15、真菌学杂志2007年8月第2卷第4期 该研究共留取用于检测血浆葡聚糖的标本182份 其中来自确诊病例和高度疑似病例 真阳性 共18份 其余为可能感染病例 18份 和无深部真菌感染病例 146份 真阴性 统计学结果提示血浆葡聚糖水平对深部真菌感染诊断的准确性优于单纯依靠各种标本真菌培养或真菌涂片是否阳性对深部真菌感染的判断 用于诊断深部真菌感染各指标ROC曲线下面积 39 血清1 3 D 葡聚糖检测在念珠菌菌血症诊断中的价值 例7 对2007年1月至2009年4月的25例念珠菌菌血症患者 60例细菌菌血症患者 25例念珠菌口咽定植者 20例健康体检者的血清1 3 D 葡聚糖含量进行比较分析 念珠
16、菌菌血症组的血清1 3 D 葡聚糖含量为115 2 42 3ng L 明显高于其他各组 其他各组间的血清1 3 D 葡聚糖含量无显著差异 结论 血清1 3 D 葡聚糖的检测是诊断念珠菌菌血症的有效指标 四组间比较 F 119 493 P0 105 念珠菌菌血症组与细菌菌血症组 念珠菌口咽定植组 健康体检组的两两比较 P值均0 05 刘英其 中国卫生检验杂志2009年9月第19卷第9期 40 血浆1 3 D 葡聚糖与抗深部白色念珠菌感染药物疗效关系的实验研究 例8 李世荣 王红 等 临床和实验医学杂志2007年第6卷第6期 本文采用110只小鼠随机分成3组 空白对照组 模型组 氟康唑组 建立深部白色念珠菌感染的动物模型 定量检测血浆中1 3 D 葡聚糖的含量 双肾组织匀浆液培养计数菌落数 用于探讨深部真菌感染小鼠血浆1 3 D 葡聚糖水平与抗真菌药物疗效的关系 各处理组不同时间点血浆1 3 D 葡聚糖的比较 治疗前模型组血浆 1 3 D 葡聚糖水平明显高于空白对照组 说明血浆1 3 D 葡聚糖水平异常升高可以反映深部真菌感染的存在 氟康唑组血浆1 3 D 葡聚糖水平随着治疗逐渐减低 从治
