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1、细胞培养中的细节问题 基础篇 无菌操作基本技术 1 实验进行前 无菌室及无菌操作台 laminarflow 以紫外灯照射30 60分钟灭菌 以70 ethanol擦拭无菌操作抬面 并开启无菌操作台风扇运转10分钟后 才开始实验操作 每次操作只处理一株细胞株 且即使培养基相同亦不共享培养基 以避免失误混淆或细胞间污染 实验完毕后 将实验物品带出工作台 以70 ethanol擦拭无菌操作抬面 操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后 再进行下一个细胞株之操作 2 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞 必要物品 例如试管架 吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置 其它实验用品用完即应移出 以利于气流之流通 实
2、验用品以70 ethanol擦拭后才带入无菌操作台内 实验操作应在抬面之中央无菌区域 勿在边缘之非无菌区域操作 3 小心取用无菌之实验物品 避免造成污染 勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口 亦不要在打开之容器正上方操作实验 容器打开后 以手夹住瓶盖并握住瓶身 倾斜约45 角取用 尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面 4 工作人员应注意自身之安全 须穿戴实验衣及手套后才进行实验 对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作 并选择适当等级之无菌操作台 至少ClassII 操作过程中 应避免引起aerosol之产生 小心毒性药品 例如DMSO及TPA等 并避免尖锐针头之伤害等 5 定期检测下列项目 5 1 C
3、O2钢瓶之CO2压力5 2 CO2培养箱之CO2浓度 温度 及水盘是否有污染 水盘的水用无菌水 每周更换 5 3 无菌操作台内之airflow压力 定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜 预滤网 300小时 预滤网 3000小时 HEPA 6 水槽可添加消毒剂 Zephrin1 750 定期更换水槽的水 基础篇 实验用品 1 种类 1 1 细胞培养实验用品均为无菌 除了玻璃容器与pasteurpipet外 其它均为塑料无菌制品 1 2 TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附 培养容器种类有Tflask plates dishes rollerbottle等 依实验需要使用 1 3
4、 plasticsterilepipet 1ml 2ml 5ml 10ml 25ml1 4 塑料离心管 15ml 50ml 均有2种不同材质 其中polypropylene PP 为不透明材质 polystyrene PS 为透明材质 可依实验需要而选择适合材质之离心管 1 5 glasspastuerpipet 9inch 用以抽掉废弃培养液等 1 6 玻璃血清瓶 PyrexorDuranglassware 100ml 250ml 500ml 1000ml 2 清洗 2 1 新购玻璃血清瓶先以0 1 0 05NHCl浸泡数小时 洗净后才开始使用 2 2 用过之玻璃血清瓶 以高压蒸汽灭菌 洗净
5、后分别用一次与二次去离子水冲洗干净 勿加清洁剂清洗 3 灭菌 3 1 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖 高压蒸汽灭菌121 15lb 20分钟 置于oven中烘干 3 2 实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170 4小时 3 3 液体或是固体废弃物可用10 hypochloride溶液 次氯酸 即漂白水 或是蒸汽高压灭菌121 15lb 20分钟处理 基础篇 培养基 1 液体培养基贮存于4 冰箱 避免光照 实验进行前放在37 水槽中温热 2 液体培养基 加血清 存放期为六个月 期间glutamine可能会分解 若细胞生长不佳 可以再添加适量glutamine 3 粉末培养基配制 以1
6、升为例 3 1 细胞培养基通常须添加10 血清 因此粉末培养基之配制体积为900ml pH为7 2 7 4 NaHCO3为另外添加 若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差 或局部过碱 因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合 然后用CO2气体调整pH 而非用强酸 HCl 或强碱 NaOH 因为氯离子对细胞生长可能有影响 且贮存时培养基的pH易发生改变 3 2 材料 纯水 milli Q水或二次至三次蒸馏水 水品质非常重要 粉末培养基 NaHCO3 电磁搅拌器无菌血清瓶 0 1或0 2mm无菌过滤膜 pH计 真空泵 CO2气体3 3 步骤 3 3 1 取粉末培养基溶于
7、700mlmilli Q水中 搅拌使其溶解 3 3 2 称取适量之NaHCO3粉末溶于200mlmilli Q水中 搅拌使其溶解 然后通入CO2气体至饱和 约3 5分钟 3 3 3 将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合 混后溶液之pH应为7 2 7 4 除非pH值偏差太大 否则不需用酸碱再调整之 若为太碱 可再通入CO2气体调整pH 培养基以真空帮浦通过过滤膜时 pH会升高0 1 0 2 3 3 4 以0 1或0 2mm无菌过滤膜过滤灭菌 同时分装至无菌容器中 标示培养基种类 日期 瓶号等 贮存于4 血清亦可加入培养基中一起过滤 3 3 5 配制之培养基配制须作生长
8、试验与污染测试 附 配制培养基之生长测试 材料 MDCKcell ATCCCCL 34或CCRC60004 6 wellTCplate or35mmTCdish methanolglacialaceticacid10 Giemsasolution GibcoBRL10092 013 步骤 1 以待测试培养基培养MDCKcell 接种MDCK细胞于6 wellplate 或35mmTCdish 中 每个well接种1 102活细胞 同时作对照组实验 2 接种5 7天后 在100倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长 待细胞群落大到可以肉眼观察 而群落间不互相接触时即可 3 去除培养基 加入1mlCar
9、noy s固定液 甲醇 冰醋酸 3 1 室温下静置10min 4 去除固定液 水洗二次 5 加入1ml10 Giemsasolution 室温下静置染色2 3min 6 去除染液 水洗二次 7 以肉眼计数群落数 并比较之 若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳 则丢弃之 基础篇 抗生素 1 细胞库之细胞培养基不加抗生素1 1 培养自ATCC引进之细胞株 培养基中不加抗生素 1 2 培养自其它实验室引进之细胞株 制作tokenfreeze前培养基须添加抗生素 待tokenfreeze通过污染测试后 大量培养时则不加抗生素 2 寄送活细胞时 须将培养液充满整个flask时 则须添加抗生素 peni
10、cillin100units ml streptomycin100ug ml 3 若要检测mycoplasma 则培养基内不可添加gentamicin 因gentamicin会抑制mycoplasma生长 4 去除细菌污染之抗生素混合配方 penicillin250units ml streptomycin250ug ml neomycin250ug ml bacitracin2 5units ml 注意混合使用后药物毒性会增强 5 抗生素使用种类与浓度 工作浓度 储存温度 杀灭细菌penicillin100units ml 20 G bacteriastreptomycin100ug ml
11、20 G andG bacteriachlotetracycline50ug ml 20 G andG bacteriagentamicin50ug ml 20 G andG bacteria mycoplasmaamphotericinB2 5ug ml 20 yeastandmoldsnystatin50ug ml 20 yeastandmoldsfungizone2 5ug ml 20 yeastandmolds 基础篇 血清 1 血清必须贮存于 20 70 若存放于4 请勿超过一个月 如果一次无法用完一瓶 可将40 45ml分装于无菌50ml离心管中 由于血清结冻时体积会增加约10 必
12、须预留此膨胀体积之空间 否则易发生污染或容器冻裂之情形 2 一般厂商提供之血清为无菌 不需再无菌过滤 若发现血清有许多悬浮物 则可将血清加入培养基内一起过滤 勿直接过滤血清 3 瓶装 500ml 血清解冻步骤 逐步解冻法 20 或 70 至4 冰箱溶解一天 至室温下全溶后再分装 一般以50ml无菌离心管可分装40 45ml 在溶解过程中须规则摇晃均匀 小心勿造成气泡 使温度与成分均一 减少沈淀的发生 勿直接由 20 直接至37 解冻 因温度改变太大 容易造成蛋白质凝结而发生沈淀 4 heat inactivation是指56 30分钟加热已完全解冻之血清 加热过程中须规则摇晃均匀 此热处理之目
13、的是使血清中之补体成份 complement 去活化 除非必须 一般不建议作此热处理 因为会造成沈淀物之显著增多 且会影响血清之品质 补体参与之反应有 cytolyticactivities contractionofsmoothmuscle releaseofhistaminefrommastcellsandplatelets enhancedphagocytosis chemotaxisandactivationoflymphocyticandmacrophagecelltype 5 勿将血清置于37 太久 若在37 放置太久 血清会变得混浊 同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏
14、而影响血清之品质 6 血清之沈淀物6 1 凝絮物 发生之原因有许多种 但普遍之原因是血清中之脂蛋白 lipoprotein 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白 fibrin 造成 这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质 若欲减少这些凝絮沈淀物 可用离心3000rpm 5min去除 或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤 不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物 因为会阻塞过滤膜 6 2 显微镜下观察之 小黑点 通常经过热处理之血清 沈淀物的形成会显著的增多 有些沈淀物在显微镜下观察像是 小黑点 常会误认为血清遭受污染 而将血清放在37 中欲培养此 微生物 但在37 环境下 又会使此沈淀物增多 更会误认
15、为微生物之增殖 但以培养细菌之培养基检测 又没有污染 一般而言 此小黑点应不会影响细胞之生长 但若怀疑此血清之品质 应立即停用 更换另一批号的血清 附 血清之生长测试 材料 MDCKcell ATCCCCL 34或CCRC60004 a MEM alphamodifiedminimalessentialmedium GibcoBRL12000 022 6 wellTCplate or35mmTCdish methanolglacialaceticacid10 Giemsasolution GibcoBRL10092 013 步骤 1 以a MEMwith10 FBS 已测试过 培养MDCK细胞
16、于T75flask至80 confluency 2 以trypsin EDTA处理细胞 离心后 加入适量不加血清之a MEM制成细胞悬浮液 并测细胞浓度 以不加血清之a MEM稀释细胞浓度为1 102活细胞数 ml 3 将1ml细胞悬浮液接种入6 wellplate中 并另加入1ml含不同浓度的血清 20 10 4 2 1 0 4 之a MEM 使血清最终浓度为10 5 2 1 0 5 0 2 用已测试过之血清同时进行对照组试验 4 37oC 5 CO2培养箱培养5 7天 期间不需更换培养基 待细胞群落大到可以肉眼观察 而群落间不互相接触即可 5 去除培养基 加入1mlCarnoy s固定液 甲醇 冰醋酸 3 1 室温下静置10min 6 去除固定液 水洗二次 7 加入1ml10 Giemsasolution 室温下静置染色2 3min 8 去除染液 水洗二次 9 以肉眼计数群落数10 计算SPE SerumPlatingEfficiency SPE no ofcolonies well 100 x100 11 计算RPE RelativePlatingEfficiency SPE t
