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1、1肠道致病菌多重 PCR 快速检测体系研究沙门菌属、志贺菌属、侵袭性大肠埃希菌、肠产毒素大肠埃希菌是常见的引起人类和动物细菌性痢疾和细菌性食物中毒的肠道致病菌，严重的危害着人类健康和牲畜的安全1 。因此，建立一种快速、简便、准确、特异地检测方法具有重要意义。目前常见病原菌的检验方法存在着检测周期长、工作量大、所需试剂多，而且假阴性率高，灵敏度低，或假阳性率高，特异性差等缺点。PCR 技术提供了理想的检测方法。本实验采用多重 PCR 方法，可在同一反应体系中检测不同的细菌，整个过程只需要 23h ，应用前景广阔。1 材料与方法11 实验菌株 肠炎沙门菌、阿柏丁沙门菌，鸡雏沙门菌，德尔比沙门菌、鼠
2、伤寒沙菌，福氏志贺 2a，福氏志贺 2b，宋氏志贺菌，枸缘酸杆菌，变形杆菌，河弧菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌(四川省疾病预防控制中心) ；产毒素大肠埃希菌 C83921，产毒素大肠埃希菌 C83902（中国兽医药品监察所） ；侵袭性大肠埃希菌（中国生物制品研究所） 。12 试剂 染料、缓冲溶液、 TaqDNA 聚合酶、dNTPs、核酸染料(GV) 、琼脂糖、 Marker 等(北京塞百盛基因技术公司 )。213 主要设备 PCR 基因扩增仪、台式高速离心机、紫外可见凝胶成像系统、核酸分析仪、微量加样枪(德国 Eppendorf 公司)；电泳槽、DYY-2 稳压稳流电泳仪 (北京市六一仪器厂
3、)。14 方法141 引物设计 沙门菌组氨酸转运操纵子基因片段具有沙门菌属特异性2-4 ，根据 Genebank V01373 提供的基因序列设计引物，即引物 1:5-ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GGT G-3；引物 2:5-ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A-3由于ipaH 基因存在于所有志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌（EIEC）的质粒和染色体上5 ，根据 Genebank M32063 提供的序列设计志贺菌和 EIEC 引物,引物序列为: 引物 1：5- TGT ATC ACA GAT ATG GCA TGC -3；引物 2：5- T
4、CC GGA GAT TGT TCC ATG TG -3。选择不耐热肠毒素(LT)的编码基因保守区6 ，根据Genebank S60731 提供的序列设计一对引物为：引物 1：5-GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G-3引物 2：5-AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C-3。142 DNA 模板的提取 采用热裂解法，取细菌培养液10ml,置于 Eppendorf 管中,8000rmin，灭菌蒸馏水洗涤 2 次,最后用 1ml 蒸馏水悬浮,隔水煮沸 10min,8000rmin，离心310min,取上清, 即为 DNA 模板溶液。143 多重 PCR
5、扩增条件的优化 通过多次试验先确定了变化较小的因素 buffer,dNTP,再对影响较大的因素如 MgCl2 浓度、引物浓度、Taq 酶用量、模板浓度，在 1 个范围内做正交实验，再进行局部微调，最后调整退火温度和循环数参数等。取 PCR 产物5l 及 DNA Marker 参照物在含有(GV)的 1%琼脂糖凝胶中电泳，电压 75V,电泳 40min 后在紫外灯下观察结果。144 多重 PCR 体系的特异性、灵敏度、样品检测 (1)特异性检测：9 株标准目的菌株和 7 株非目的菌株 ,提取 DNA 模板,然后进行 PCR 扩增，电泳后观察有无条带的出现。(2) 灵敏度检测：将从目的菌株提取的
6、DNA 模板用核酸分析仪测定 DNA 含量,然后作 10 倍梯度稀释,取每个稀释度的 DNA 进行 PCR 扩增,电泳后观察条带的亮度,直到不出现扩增带为止。(3) 样品的检测：从牛肉中分离的可疑菌株,提取 DNA 模板,进行多重 PCR 扩增。同时,按常规进行生化检验和玻板凝集试验。145 PCR 试剂盒组成 经反复试验,组装多重 PCR 试剂盒。包括 PCR 反应管,PCR 反应液染料，缓冲溶液（Mg2+） ，dNTP，引物, 琼脂糖粉,GoldView 染料，Taq 酶,阳性对照,阴性对照, 液体石蜡。42 结果21 PCR 反应条件的优化 反应体积 50l,10buffer 5l，引物
7、各 025l（50mol/L ）,Taq 聚合酶 08l(5U/l),dNTPs 2l（ 10mmol/L）, 粗提 DNA 模板各 1l。扩增条件:94预变性4min,94变性 45s,退火 5840s,延伸 7260s,32 个循环，最后72保温 5min，见图 1。1：肠炎沙门菌；2：阿柏丁沙门菌； 3：鸡雏沙门菌；4：德尔比沙门菌；5：鼠伤寒沙门菌； 6：产毒素大肠埃希菌C83902；7：产毒素大肠埃希菌 C83902； 8：福氏志贺 2a；9：福氏志贺 2b；10：宋氏志贺；11：侵袭性大肠埃希菌；12：肠炎沙门菌+产毒素大肠埃希菌；13：产毒素大肠埃希菌 +福氏志贺2a；14：肠炎
8、沙门菌+福氏志贺 2a；15：福氏志贺 2a+肠炎沙门菌+ 产毒素大肠埃希菌；16：肠炎沙门菌+产毒素大肠埃希菌+福氏志贺 2a；17 ：肠炎沙门菌+产毒素大肠埃希菌+ 福氏志贺 2a图 1 多重 PCR 反应检测结果（略）22 特异性 用所建立的方法检测沙门菌、志贺菌属、侵袭性大肠埃希菌、肠产毒素大肠埃希菌均扩增出特异的、与预期结果5相符的 DNA 片段, 未见非特异性扩增带，且其他的非目的菌株未扩增出条带。23 灵敏度 单独及多重 PCR 体系中几种菌的灵敏度均达到10-8fg/l,两体系灵敏度一致,即沙门菌属为 91310-8fg/l，志贺菌属（侵袭性大肠埃希菌）为 72310-8fg/
9、l，肠产毒素大肠埃希菌 23410-8fg/l，见图 2。M：DNA Marker；1 4：各模板 DNA 稀释度分别为 10-1，10-2，10-3，10-4 倍图 2 多重 PCR 反应灵敏度检测结果（略）24 牛肉中志贺菌的检测 用多重 PCR 方法从牛肉中共检测出 9 个阳性样品。经国家标准卫生检验方法验证均为阳性7 。25 试剂盒稳定性和重复性 除 Taq 酶,PCR 反应液,阴、阳性模板置-20 贮存外 ,其余试剂均 4条件下贮存。在贮存时间为30，60，90，120，150，180 ，210，240，270 和 300d 时取出,用已知 PCR 阳性样品检测试剂盒的稳定性,结果直
10、到 300d,样品PCR 仍呈阳性,说明该试剂盒的有效期在 300d 以上。此外,PCR 阳性样品用试剂盒重复试验 3 次,结果均为阳性 ;而 PCR 阴性样品重复试验 3 次, 均为阴性。说明该试剂盒的重复性好。63 讨论本研究在于应用多重 PCR 快速检测肠道致病菌，考虑到引物间的配对、引物间的竞争性扩增、退火温度等均可影响多重 PCR 的扩增效果8 ，因此，查找的序列均具有很强的保守性，设计的 3对引物之间不能相互配对，形成二聚体或发夹结构，Tm 值基本一致等。对选取的目的菌株和非目的菌株同时进行 PCR 扩增,结果目的菌株均显示出特异扩增,而所有非目的菌株均不出现扩增条带,说明引物具有
11、很强的特异性。多重 PCR 影响因素复杂,不同的引物、模板、引物浓度、模板浓度、Mg2+浓度、dNTP 浓度及其比例、缓冲液成分与浓度、反应体系、循环参数等会产生复杂的综合效应 。本体系中 10buffer,dNTPs,模板量等对多重扩增的影响不大,Taq 酶、引物、 Mg2+浓度、循环次数、退火温度等对 PCR 反应的特异性和反应效率影响较大。通过优化 PCR 反应体系和条件,使实验效果达到了最佳，且几种细菌随机组合的扩增也获成功,未出现相互间强抑制现象。PCR 试剂盒的稳定性和重复性试验表明,该试剂盒重复性好,有效期长, 特异性强，灵敏度高，结果准确,对待检样品要求不高,检测时间更短等。通
12、过对牛肉样品的检测,显示 PCR 法阳性率明显高于培养法,且培养法阳性的样品,PCR 法均为阳性,说明试验结果可靠。因此,该试剂盒有一定的应用价值,可在生产生活中推广应用。7【参考文献】1 韩文瑜. 病原细菌检验技术M.长春：吉林科学技术出版社,1992：1-78.2 Cohen ND,Neibergs HL,Megruder ED,et al.Genus-specific detection of Salmonellae using the polymerase chain reaction (PCR)J.J Vet Diagn Invest,1993,5(3):368-371.3 Cohe
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14、lmonella enteritidis in feces from poultry using booster polymerase chain reaction and oligonucleotide primers specific for all members of the genus SalmonellaJ.Poult Sci,1994,73(2):354-357.85 Venkatesan MM,Buysse JM,kopecko DY.Use of shigella flexnery ipaC and ipaH gene sequence for the general ide
15、ntification of shigella spp.and enterioinvasive E.coliJ .J Clin Microbiol,1989,27:2671-2691.6 Stacy-phipps S,Mecca JJ,Weiss JB.Multiplex PCR assay and simple preparation method for stool specimens detect Enterotoxigenic Escherichia coli DNA during course of infectionJ.J Clin Microbiol,1995,33:1054-1059.7 罗雪云，刘宏道，周桂莲，等.食品微生物检验标准手册M.北京：中国标准出版社，1995 ：58-66.8 黄银花,胡晓湘, 徐慰倬,等.影响多重 PCR 扩增效果的因素J. 遗传,2003,25(1):65-68.9 张学敏，王宜强 .靶向新基因的分子克隆策略 理论与方法M.北京: 军事医学科学院出版社,1999：1-11.
