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1、主讲人 赛哲生物 曾宏彬 水凝胶三维细胞培养 广州赛哲生物科技有限公司 服务热线 400 888 4242 什么是三维细胞培养 如何实现三维细胞培养 水凝胶三维细胞培养 更多问题 2 341 广州赛哲生物科技有限公司 服务热线 400 888 4242 什么是三维细胞培养 建立体外三维培养模型将有助于跨越二维细胞培养与动物实验之 间的鸿沟 通过模仿体内环境的特性 并利用传统的细胞培养研究工 具 三维细胞模型提供了独特的视角来观察干细胞的行为 组织器官 和肿瘤的发展过程 这些研究模型有利于加速癌症生物学和组织工程 领域的转化研究 Kenneth M Yamada and Edna Cukierm
2、an Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D J cell 130 601 610 1 1 什么是三维细胞培养 3D2D VS 2 如何实现三维细胞培养 水凝胶固体支架磁力悬浮 2 如何实现三维细胞培养 固体支架三维培养 组织工程支架作为组织工程的平台 不仅提供了细胞生长的框架 使之形成特 定的组织或器官形状 而且作为细胞外基质成分之一 是细胞间信号传导和相互作 用的媒介 同时也是细胞生长所必需的生物活性剂 目前用于组织工程支架的人工合成可降解聚合物主要包括脂肪族聚酯 聚偶磷 氮 聚酸酐等 其中研究最多的是脂肪族聚酯 特别是聚乳酸 PLA
3、聚乙醇酸 PGA 及其共聚物等 2 如何实现三维细胞培养 磁力悬浮三维培养 美国莱斯大学和德克萨斯大学M D Anderson 癌症中心的研究人员开发出一种生物装配器 bioassembler 这个系统使用磁力让细胞悬浮 并促使细胞生长成三维的形状 尤其适于培养肝脏 和心脏这种细胞密度比较大的实体器官 文章发表在2013年3月14日的 Nature Nanotechnology 上 2 如何实现三维细胞培养 将细胞培植在一定的细胞外基质中 细胞外基质 extracellularmatrix ECM 蛋白充当生长支架 水凝胶三维培养 3 水凝胶三维细胞培养 Matrigel Collagen I
4、 Agarose 3 水凝胶三维细胞培养 从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出BD Matrigel 基 底膜基质 其主要成分由层粘连蛋白 型胶原 巢蛋白 硫酸肝 素糖蛋白等组成 还包含生长因子和基质金属蛋白酶等 Matrigel 在室温条件下 聚合形成具有生物学活性的三维基质 模拟体内细胞基底膜的结 构 组成 物理特性和功能 有利于体外细胞的培养和分化 以及对细胞形态 生化 功能 迁移 侵染和基因表达的研究 可促进上皮细胞 肝细胞 Sertoli细胞 黑色素瘤细胞 血管内皮细胞 甲状腺 细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化 同时 Matrigel还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达 支持外周神经的新
5、生和牛输卵管上皮细胞的分化 高浓度的Matrigel适用于研究体 内血管生成和肿瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等 3 水凝胶三维细胞培养 I型胶原在大部分组织中都有分布 尤其在骨组织 肌腱以及 真皮组织中含量极其丰富 I型胶原一般是分离自大鼠尾中 也常 被称为鼠尾胶 Agarose 在酸性条件下成液态 一般保存于醋酸溶液中 使用时 需用PBS稀释成合适的 浓度 大于1 mg ml 并用氢氧化钠调节PH值至7 2 7 4 可聚合形成具有生物学活 性的三维基质 一般用于软骨细胞 骨细胞的三维培养 血管形成试验等 3 水凝胶三维细胞培养 美国布朗大学的生物工程师 Jeffrey Morgan 利用琼脂糖
6、开发 出一种细胞三维培养皿 Collagen I 将融化的琼脂糖制成微型培养板 micro moulds 等琼脂糖凝固 之后 再将这种琼脂糖材料放置到普 通的培养板里 再在培养板里加入细 胞和培养基 由于重力的作用 细胞 会沉积到琼脂糖培养板里 彼此聚集 在一起 形成球形的多细胞团块 3 水凝胶三维细胞培养 试剂盒组分 BD Matrigel PBS缓冲液 细胞回收液 赛哲生物 水凝胶三维细胞培养系列试剂盒 SZCE13001 SZCE13010 乳腺癌系列 胃癌系列 宫颈癌系列 肝癌系列 肺癌系列 分别用于胶上培养 胶内培养 3 水凝胶三维细胞培养 胶内培养胶上培养 铺胶 接种细胞 培养 收
7、集细胞 Or 观察与检 测 3 水凝胶三维细胞培养 铺胶 胶上培养 薄胶 30 50 L cm2 形成约0 5 mm厚度的凝胶 胶内培养 薄胶 可选 厚胶 100 200 L cm2 形成大于1 mm厚 度的厚胶 操作步骤 l铺胶前的准备 Matrigel 置于冰上融解 使用到的所有器材 吸头 小管 培养板 须冰预冷 l铺胶 薄胶 用冰预冷的吸头吸取60 100 L 液态的Matrigel 均匀涂抹孔 板底部 使其厚度均匀 避免产生气泡 在37 放置30分钟 即可成胶 3 水凝胶三维细胞培养 接种和培养 胶上培养 制备细胞悬液 以合适的密度接种于薄胶上 即可进行培养 胶内培养 制备细胞悬液 调
8、整至合适的细胞密度 取 100 200 L 与 Matrigel 等比例混合均匀 接种于孔板中 在37 放置30分钟 成胶后 在胶面上轻轻加入完全培养基即可进行培养 TIPS l 一般用于肿瘤微球形成 侵袭等观察 接种密度应控制在2000 3000 cells 孔 l 观察血管形成接种密度需达到105 cells 孔 3 水凝胶三维细胞培养 细胞处理 l 药物刺激 胶上层培养液中加入刺激药物 l 细胞转染 胶上培养 使用sagene 3D HG SC1201 三维培养专用转染试剂 使用慢病毒or 腺病毒感染 胶内培养 使用慢病毒or 腺病毒感染 3 水凝胶三维细胞培养 细胞的回收 细胞回收液
9、cell recovery solution 不含酶 能够解聚matrigel 1 2ml细胞回收液 轻轻刮起含有细胞的凝胶 禁止吹吸 转入 2ml离心管中 置于冰上融解约30min 每隔5 10min来回颠倒一次 待 观察到细胞团可顺利沉至管底部 4 3000rpm离心5min 收集细胞 优点 细胞可保持在胶内的形态 不含酶 对细胞伤害小 缺点 凝胶去除不彻底 有可能影响到后续检测 3 水凝胶三维细胞培养 细胞的回收 酶消化 l 胰酶 0 25 1 2ml 酶液 置于37 消化15 30min 待观察到细胞团逐渐散开 3000rpm 离心5min 收集细胞 优点 凝胶去除较彻底 缺点 对细胞
10、伤害较大 继续培养效果差 l 分散酶 dispase 1 2ml 酶液 置于37 消化2 hours 待观察到细胞团逐渐散开 3000rpm离 心5min 收集细胞 优点 凝胶去除较彻底 对细胞伤害小 可继续培养 缺点 耗时长 价格高 3 水凝胶三维细胞培养 观察与检测 形态观察 乳腺上皮细胞MCF 10A细胞形成的乳腺腺泡结构 前列腺癌细胞PC3的侵袭性观察 3 水凝胶三维细胞培养 观察与检测 实时荧光定量PCR检测 mRNA miRNA 抽提RNA 不需要除去凝胶 可直接加入trizol or bioopure 抽提RNA 样品编号260 280Conc ng ul 12 072068 2
11、2 041802 2 32 111660 8 42 061267 4 1 2 3 4 1 不去胶 2 不去胶 3 去胶 4 去胶 Amplification plot of Actin 3 水凝胶三维细胞培养 观察与检测 不去胶 去胶 GAPDH Western blot检测蛋白 若检测大分子蛋白 一定要除去 凝胶 回收细胞后提取蛋白 细胞回收液或酶消化均可 3 水凝胶三维细胞培养 观察与检测 细胞增殖检测 MTT法 不需要除去凝胶 可直接加入 MTT孵育 一定要设不含细胞 只含有凝 胶的空白对照孔 3 水凝胶三维细胞培养 观察与检测 免疫荧光观察蛋白定位 胶上培养 可直接固定 孵育抗体等操作
12、 胶内培养 需回收细胞 采用细胞回收液回收细胞 维持细胞团结构 重新接种于圆形盖 玻片上 使细胞贴附于玻片上 再进行固定 抗体孵育等步骤 TIPS l 抗体孵育或染色后 洗涤次数需增加 时间最好延长至15min l 若需进行激光共聚焦观察 可直接在厚度为0 13 0 17mm圆形盖 玻片上铺胶接种细胞 3 水凝胶三维细胞培养 观察与检测 免疫荧光观察蛋白定位 不去胶 去胶 DAPI tublinoverlay 3 水凝胶三维细胞培养 观察与检测 免疫荧光观察蛋白定位 S1 cell T4 2 cell CAR E Cadherin Confocal Fluorescence Microscop
13、y 3 水凝胶三维细胞培养 试剂盒组分 Salmon fibringen Salmon thromin PBS缓冲液 酶消化液 赛哲乳腺癌肿瘤干细胞筛选试剂盒 专利产品 采用Salmon fibringen在 Salmon thromin的作用下 形成血纤蛋白凝胶 通过 调节纤维蛋白原的浓度使形成的水凝胶的硬度在80 100pa范围内 使乳腺癌干细胞 能够在基质中增殖 并维持其自我更新的特性 从而筛选获得肿瘤干细胞微球 3 水凝胶三维细胞培养 CD24 A C CD44 CD24 GAPDH 筛选后 筛选前 CD44 BD 3 水凝胶三维细胞培养 案例分析 内容内容 Any Question 4 更多问题 THANK YOU THANK YOU
