《联合应用细胞遗传学、巢式RTPCR和FISH技术检测慢性髓系白血病治疗过程中的肿瘤负荷》由会员分享，可在线阅读，更多相关《联合应用细胞遗传学、巢式RTPCR和FISH技术检测慢性髓系白血病治疗过程中的肿瘤负荷（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1联合应用细胞遗传学、巢式 RTPCR 和 FISH 技术检测慢性髓系白血病治疗过程中的肿瘤负荷作者：王慧萍李国霞 乔振华 王宏伟【摘要 】 本研究探讨常规细胞遗传学(conventional cytogenetics, CC)、巢式逆转录 聚合酶链反应(nestedreverse transcriptase polymerase chain reaction, nestedRTPCR)及双色双融合荧光原位杂交(dualcolor and dualfusion fluorescence in situ hybridization, DFISH) 三种技术监测慢性髓系白血病(chronic my
2、eloid leukemia， CML)患者造血干细胞移植治疗过程中肿瘤负荷的灵敏度和特异性。联合应用 CC、巢式RTPCR 和 DFISH 三种技术对 7 例 CML 患者非清髓性异基因干细胞移植治疗前后的肿瘤负荷水平进行检测。检测结果显示： 7 例CML 患者治疗前后的 40 份骨髓标本中，有 29 份标本检出不同比率的 Ph 染色体； 3 份因细胞数少 CC 分析失败；36 份标本RTPCR 检测结果为阳性。病例 1 移植后 12、18 、26 及 38 个月的 4 份标本 Ph 染色体及 RTPCR 结果均为阴性。病例 1 移植后9、10 个月、病例 2 移植后 15 个月、病例 3
3、移植后 12 个月的 4份 Ph(-)bcr/abl(+)标本经 FISH 检测，分别检出 5.4%、 0%、 16.5%及 1.5%的 bcr/abl(+)细胞。病例 5 移植后 20、60 天、病例27 移植后 40 天的 3 份标本因细胞数少而 CC 核型分析失败，对其行FISH 检测，结果 bcr/abl(+)细胞检出率分别为 55.0%、27.5% 和73.5%。病例 1 移植后 12 个月 Ph(-)bcr/abl(-)的标本行 FISH 检测，结果 bcr/abl(+)细胞检出率为 0%。结论： CC 可作为监测 CML 患者治疗过程中肿瘤负荷水平的基本手段。在移植后早期细胞数太
4、少而无法进行 CC 检测，以及治疗病人体内肿瘤负荷降低到 CC 不能检出而 RTPCR 仍为阳性时，借助 FISH 准确检测体内肿瘤负荷，以监测其动态变化。FISH 检测 bcr/abl 转阴的病人需靠灵敏度更高的 RTPCR 监测核定。 【关键词】 慢性髓系白血病；细胞遗传学；聚合酶链反应；荧光原位杂交Detection of Tumor Load in Chronic Myeloid Leukemia During Treatment with Transplantation by Conventional Cytogenetics, NestedRTPCR and FISHAbstrac
5、t This study was purposed to investigate the sensitivity and specificity of conventional cytogenetics (CC),nestedreverse transcriptase polymerase chain reaction (nestedRTPCR) and dualcolor / dualfusion fluorescence in situ hybridization (DFISH) technique in monitoring the 3tumor load of chronic myel
6、oid leukemia (CML) during treatment with transplantation. CC, nestedRTPCR and interphase DFISH were simultaneously carried out to detect the tumor load of 7 CML patients during treatment with nonmyeloablative allogentic stem cell transplantation(alloNSCT).40 specimens from 7 CML patients before and
7、after alloNSCT were analyzed. The results showed that 29 specimens were Ph(+) with different positive ratio and 3 specimens with lower cells were not analyzed by CC. 36 specimens were bcr/abl mRNA (+) by RTPCR. 4 specimens from case 1 at 12，18，26 and 38 months after alloNSCT were Ph(-) and bcr/abl m
8、RNA (-),4 Ph(-)bcr/abl(+) specimens containing 2 from case 1 at 9 and 10 months after alloNSCT, 1 from case 2 at 15 months after alloNSCT, 1 from case 3 at 12 months after alloNSCT showed 5.4%, 0%, 16.5% and 1.5% bcr/abl(+) cells by FISH. 3 specimens with lower cells containing 2 from case 5 at 20 a
9、nd 60 days after alloNSCT and 1 from case 7 at 40 days after alloNSCT were analyzed by FISH and showed 55.0%, 27.5% and 73.5% bcr/abl(+) cells. The Ph (-) bcr/abl(-) specimen from case 1 at 12 monthss postalloNSCT showed 0% bcr/abl (+) cells by FISH. It is concluded that CC can be used 4as a basic t
10、ool to monitor the change of tumor load in CML during treatment. When specimen with lower cells can not be analyzed by CC in early period after alloNSCT, or result of CC can not evaluate precisely dynamic change of tumor load and when tumor load in treated patient are lower to Ph(-) by CC while bcr/
11、abl mRNA (+) by RTPCR, FISH must be used to detect precisely tumor load and monitor dynamic change of it. More sensitive RTPCR is used to monitor tumor load when it is lower to bcr/abl(-) by FISH during treatment.Key words chronic myeloid leukemia; cytogenetics; polymerase chain reaction; fluorescen
12、ce in situ hybridizationPh 染色体是慢性髓系白血病（CML）的标志染色体，其本质是t(9;22)(q34;q11)易位，易位的结果使位于 9 号染色体长臂 3 区 4带 (q34) 上的 cabl 原癌基因与 22 号染色体长臂上一个功能未明的断裂点簇集区(breakpoint cluster region, BCR)发生拼接，形成bcr/abl 融合基因。易位形成的 Ph 染色体及相应的 bcr/abl 融合基因是 CML 发病的分子基础，也是 CML 的恶性克隆标志。在评价CML 对各种治疗如 INF、骨髓移植、格列卫等的反应程度时，准确判断患者骨髓细胞中的肿瘤负
13、荷十分重要。我们联合应用常规细胞遗传学(CC)、巢式逆转录 聚合酶链反应(nestedRTPCR) 及双5色双融合荧光原位杂交(DFISH) 技术对 7 例非清髓性异基因干细胞移植治疗的 CML 患者的肿瘤负荷水平进行检测，探讨 3 种技术对监测 CML 患者治疗过程中肿瘤负荷的灵敏度和特异性。病例7 例 CML 患者系我院血液科 2001 年 9 月-2005 年 1 月就诊的住院病人,均符合 血液病诊断及疗效标准临床诊断标准，其中男性 5 例, 女性 2 例，年龄 19-56 岁，中位年龄 38 岁。7 例患者均行非清髓性异基因干细胞移植，术后根据临床反应及嵌和体形成情况给予供体淋巴细胞输
14、注。阴性对照为 3 例健康供体骨髓细胞 ,阳性对照为 K562 细胞。常规细胞遗传学分析采用骨髓直接法和(或)24 小时短期培养法按常规制备染色体并进行显带核型分析。染色体核型异常按人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)(1995)进行描述,每份标本至少分析 10 个中期细胞。bcr/abl 融合基因转录本的巢式 RTPCR 检测6巢式 RTPCR 按我室常规方法进行。外测引物序列为：C:5GCTTCTCCCTGACATCCGTG3，D:5CGAGCGGCTTCACTCAGACC3内测引物序列为：A:5CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG3，B:5CAGACCCTGAGGCTCAA
15、AGTCAGA3，每次实验均设阳性和阴性对照，只有阳性对照为阳性，阴性对照为阴性时结果才视为可靠。bcr/abl 融合基因的 DFISH 法检测1bcr/abl 融合基因探针 LSI BCRABL DFISH 探针由美国 Vysis公司提供。FISH 检测 取出保存于 -20的染色体标本,换上新鲜固定液(甲醇冰醋酸=31)滴片, 室温气干后放入 37 预温的 2SSC 中 30分钟，分别在 70%、85%、100% 的乙醇( 体积比) 中室温梯度脱水,每梯度 2 分钟, 晾干。 在 73变性液(70%的甲酰胺/2SSC)中变性 5 分钟, 70%、85%、100%冰乙醇(-20)系列脱水, 每
16、梯度 2 分钟, 晾干备用。将 1 l 混合探针与 9 l 杂交稀释液（hybridization buffer，购自 Vysis 公司 )混合,在 73水浴中变性 5 分钟, 然后加在染色体标本上,盖片封胶, 放入预热的湿盒中 , 37杂交过夜。杂交后标本在 73 0.4SSC/0.3% Triton100 中洗涤 2 分钟, 再用2SSC/0.1% Triyon100 室温洗涤 1 分钟 , 避光晾干后加 10 l 二7氨基酚吲哚(DAPI)复染标本, 20 分钟后荧光显微镜检测。荧光显微镜检查 在 NikonE600 荧光显微镜下通过三色滤光块(DAPI/TRITC/FITC)观察杂交信号, 每例至少分析 200 个间期细胞,不计数重叠细胞，计算阳性细胞的百分比率。FISH 结果判断标准:红色(red
