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1、课题课题3 3 分解纤维素的分解纤维素的 微生物的分离微生物的分离 目标 1 知道纤维素酶的种类及作用 2 初步掌握从土壤中分离出分解纤维 素的微生物的实验方法 纤维素与纤维素酶 纤维素与纤维素酶 1 1 纤维素纤维素 纤维素是一种由纤维素是一种由葡萄糖葡萄糖首尾相连而成的首尾相连而成的高高 分子分子化合物 是含量最丰富的化合物 是含量最丰富的多糖多糖类物质 类物质 一 基础知识 植物的根 茎 叶等器官都含有大量的纤植物的根 茎 叶等器官都含有大量的纤 维素 其中维素 其中棉花棉花是自然界中纤维素含量最高是自然界中纤维素含量最高 的天然产物的天然产物 思考 纤维素是地球上含量最丰富的 多糖类物
2、质 植物每年产生的纤维素 超过70亿吨 但却不会在地球上大量 的积累 为什么 纤维素能被土壤中某些微生物分解纤维素能被土壤中某些微生物分解 利用 这是因为它们能够产生利用 这是因为它们能够产生纤维素酶纤维素酶 土壤中某些微生物能够产生纤维素酶土壤中某些微生物能够产生纤维素酶 把把 纤维素分解为葡萄糖 后再利用 纤维素分解为葡萄糖 后再利用 在草食性动物等的消化道内 也共生有 分解纤维素的微生物 其原理也是产生纤维 素酶而分解纤维素 而人没有分解纤维素的 能力 人类可应用分解纤维素的微生物将秸人类可应用分解纤维素的微生物将秸 秆等废弃物转变成酒精 用纤维素酶处理秆等废弃物转变成酒精 用纤维素酶处
3、理 服装面料等 服装面料等 草食性动物是怎样消化食物中纤维 素的 下列生物能分解纤维素的是 人 兔 牛 蘑菇 纤维杆菌 A B C D C 即 能分解纤维素的微生物有各种细菌 真菌和少数放线菌 动物则为草食性动物 2 2 纤维素酶纤维素酶 纤维素酶是一种纤维素酶是一种复合酶复合酶 一般认为它 一般认为它至少至少 包括三种组分包括三种组分 即 即C C 1 1 酶酶 外切酶外切酶 C C X X 酶酶 内切酶内切酶 和葡萄糖苷酶和葡萄糖苷酶 前两种酶使纤维素分解成纤维 前两种酶使纤维素分解成纤维 二糖 第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖 二糖 第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖 纤维二糖 C1酶 Cx酶
4、葡萄糖苷酶 葡萄糖纤维素 取二支20mL的试管 实验 纤维素酶分解纤维素的实验 各加入一张滤纸条 各加入pH4 8 物质量为0 1mol L 的醋酸 醋酸钠缓冲液11ml和10ml 甲 乙 在乙试管中加入1mL纤维素酶 两支试管固定在锥形瓶中 放在 140r min的摇床上振荡1h 结果 乙试管的滤纸条消失 讨论 乙试管的滤纸条为什么会消失 甲试管的作用是 什么 提示 本实验的自变量是纤维素酶的有无 自变 量的操纵方法是 在一支试管中添加适量 1mL 的纤维素酶溶液 在另一支试管不添加纤维 素酶 但需加入等量的缓冲液 不能加入蒸馏 水 否则会影响溶液的pH 实验分析 P27的小实验是如何构成对
5、照 的 二 纤维素分解菌的筛选 1 筛选纤维素分解菌的方法是 该方法可以通 过 反应直接筛选 刚果红染色法 颜色 2 其原理是 刚果红可以与纤维 素形成 当纤维素被 分解后 红色复合物无 法形成 出现以 为 中心的 我们可以通过 来筛选纤维素分解菌 红色复合物 纤维素酶 纤维素分解菌 透明圈 是否产生透明圈 练一练 1 下列关于纤维素酶的说法 错误的是 A 纤维素酶是一种复合酶 至少包括三种 B 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖 C 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁 D 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖 2 利用刚果红法可以筛选出纤维素分解 菌 下列说法错误的是 A 刚果红能与纤维素形成红色复合物
6、 B 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物 D 若培养基上产生了透明圈 则说明已筛 选出了纤维素分解菌 土壤取样选择培养梯度稀释 将样品涂布到鉴 别纤维素分解菌 的培养基上 挑选产生 透明圈的 菌落 分布环境分布环境 1 1 土壤取样 土壤取样 富含纤维素的环境中富含纤维素的环境中 操作步骤操作步骤 生物与环境的互相依存关系 在富含纤维素 的环境中纤维素分解菌的含量相对提高 因此从 这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环 境 原因原因 实例 树林中多年落叶形成的腐殖土 多年积实例 树林中多年落叶形成的腐殖土 多年积 累的枯枝败叶等 累的枯枝败叶等 讨论讨论
7、 如果找不到合适的环境 可以将滤纸埋如果找不到合适的环境 可以将滤纸埋 在土壤中 将滤纸埋在土壤中有什么作用 你认在土壤中 将滤纸埋在土壤中有什么作用 你认 为滤纸应该埋在土壤中多深 为滤纸应该埋在土壤中多深 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对 集中 实际上是人工设置纤维素分解菌生存的 适宜环境 一般应将滤纸埋于深约10cm左右的 土壤中 2 2 选择培养 选择培养 增加纤维素分解菌的浓度增加纤维素分解菌的浓度 以确保能够从 以确保能够从 样品中分离所需要的微生物 样品中分离所需要的微生物 目的 目的 制备选择培养基 制备选择培养基 操作 操作 将土样加入装有将土样加入装有30ml30ml选
8、择培养基的锥形瓶选择培养基的锥形瓶 中 将锥形瓶固定在摇床上 在一定温度下震中 将锥形瓶固定在摇床上 在一定温度下震 荡培养荡培养1 1 2 2天 直至培养液变浑浊 也可重复天 直至培养液变浑浊 也可重复 选择培养 选择培养 在选择培养的条件下 可以使那些能够在选择培养的条件下 可以使那些能够适适 应应这种营养条件的微生物得到这种营养条件的微生物得到迅速繁殖迅速繁殖 而那 而那 些些不适应不适应这种营养条件的微生物的繁殖被这种营养条件的微生物的繁殖被抑制抑制 因此可以起到 因此可以起到 浓缩浓缩 的作用 的作用 为什么选择培养能够为什么选择培养能够 浓缩浓缩 所需的微生物 所需的微生物 培养基
9、成分分析 培养基组组成 提供主要的营营养物质质 纤维纤维 素粉 5g碳源 能源 NaNO3 1g氮源 无机盐盐 KCl 0 5g Na2HPO4 7H2O 1 2g KH2PO4 0 9g MgSO4 7H2O 0 5g 无机盐盐 酵母膏 0 5g生长长因子 碳源 氮源 水解酵素 0 5g氮素 生长长因子 溶解后 蒸馏馏水定容至1000mL水 提示 自变量为培养基的种类 即普通培养基和选择 培养基 可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照 或者将纤 维素改为葡萄糖 A A 旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基 为什么 旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基 为什么 是液体培养基 原因是配方中无凝固剂
10、琼脂 是液体培养基 原因是配方中无凝固剂 琼脂 B B 这个培养基对微生物是否具有选择作用 如果具有 这个培养基对微生物是否具有选择作用 如果具有 是如何进行选择的 是如何进行选择的 有选择作用 本配方中纤维素作为主要碳源 只有能 分解纤维素的微生物可以大量繁殖 C C 你能否设计一个对照实验 说明选择培养基的作用 你能否设计一个对照实验 说明选择培养基的作用 思考 本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些 异同 本实验流程与课题2的流程的区别如下 课 题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为 唯一氮源的选择性培养基上 直接分离得到菌 落 本课题通过选择培养 使纤维素分解菌得 到增殖后 再将菌
11、液涂布在鉴别培养基上 其 他步骤基本一致 说明 说明 分析分析 纤维素分解菌的选择培养基纤维素分解菌的选择培养基 配方配方 可知 该配方中的酵母膏也能够提供少可知 该配方中的酵母膏也能够提供少 量的碳源 因此其他微生物也能在该培养基中量的碳源 因此其他微生物也能在该培养基中 生长繁殖 只不过 由于酵母膏的含量极少 生长繁殖 只不过 由于酵母膏的含量极少 因此 只有以纤维素为碳源的微生物才能大量因此 只有以纤维素为碳源的微生物才能大量 繁殖 繁殖 比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌 选 择 培 养 基 原理 培养基 类型 目的 鉴 定 培 养 基 原理 现象 方法 将细菌涂布在只有 尿素做氮源的
12、选择 培养基上 将细菌培养在只有 纤维素粉做碳源的 选择培养基上 固体培养基 液体培养基 筛选菌株选择培养 增加浓度 按照课题按照课题1 1的稀释操作方法 将选择培养后的稀释操作方法 将选择培养后 的培养基进行等比稀释的培养基进行等比稀释1010 1 1 1010 7 7 倍 倍 3 3 梯度稀释梯度稀释 101102103104 105106 4 4 将样品涂布到将样品涂布到鉴别纤维素分解菌鉴别纤维素分解菌的培养的培养 基上基上 制备培养基制备培养基 参照课本旁栏中的比例配制 参照课本旁栏中的比例配制 倒平板操作倒平板操作 涂布平板 涂布平板 将稀释度为将稀释度为1010 4 4 1010
13、6 6 的菌悬液各的菌悬液各 取取0 1ml0 1ml涂布到平板培养基上 涂布到平板培养基上 3030 倒置培养 倒置培养 挑选产生透明圈的菌落挑选产生透明圈的菌落 参照课本刚果红染参照课本刚果红染 色法 挑选产生透明圈的菌落色法 挑选产生透明圈的菌落 即为分解纤维素即为分解纤维素 的菌落的菌落 培养基组组成提供的主要营营养物质质 CMC Na 5 10g 碳源 酵母膏 1g碳源 氮源 生长长因子 KH2PO4 0 25g无机盐盐 土豆汁 100mL碳源 生长长因子 琼琼脂 15g凝固剂剂 上述物质质溶解后 加蒸 馏馏水定容至1000mL 氢氢元素 氧元素 鉴别纤维素分解菌的培养基 水溶性羧甲
14、基纤维素钠 方法一 先方法一 先 再加入刚果红进 再加入刚果红进 行颜色反应 行颜色反应 方法二 在方法二 在 时就加入刚果红 时就加入刚果红 培养微生物培养微生物 倒平板倒平板 5 5 刚果红染色法刚果红染色法 挑选产生透明圈的菌落 一般即为分解挑选产生透明圈的菌落 一般即为分解 纤维素的菌落 纤维素的菌落 这两种方法各有哪些优点与不足 这两种方法各有哪些优点与不足 染色法染色法优优优优点点缺点缺点 方法一方法一 方法二方法二 颜色反应基本颜色反应基本 上是纤维素分上是纤维素分 解菌的作用解菌的作用 操作繁琐操作繁琐 刚果红会使菌落之间发生刚果红会使菌落之间发生 混杂混杂 操作简便不操作简便
15、不 存在菌落混存在菌落混 杂问题杂问题 1 1 产生淀粉酶的微生物也产生淀粉酶的微生物也 产生模糊透明圈产生模糊透明圈 2 2 有些微生物能降解色素有些微生物能降解色素 形成明显的透明圈 形成明显的透明圈 方法一中NaCl溶液的作用 思考 漂洗作用 洗去与纤维素结合不牢的刚果红 以免出现的透明圈不够清晰 比较 项目 分解尿素的细菌纤维素分解菌 选 择 培 养 原理 培养基类 型 目的 鉴 定 培 养 基 原 理 现 象 方 法 在细菌分解尿素的化学反应 中 细菌合成的脲酶将尿素 分解成了氨 氨会使培养基 的碱性增强 pH升高 在培 养基中加入酚红指示剂 如 果pH升高指示剂会变红 刚果红可以与
16、纤维素形成 红色复合物 当纤维素被 纤维素酶催化分解后红色 复合物无法形成 培养基 上就会出现以纤维素分解 菌为中心的透明圈 观察菌落周围是否有红色的 环带出现来鉴定尿素分解菌 观察菌落周围是否出现 透明圈来筛选纤维素分解菌 脲酶检测法刚果红染色法 在在产生明显的透明圈产生明显的透明圈的菌落 挑取的菌落 挑取 并接种到纤维素分解菌的选择培养基上并接种到纤维素分解菌的选择培养基上 在 在3030 0 0 C C 3737 0 0 C C培养 可获得培养 可获得纯化培养纯化培养 6 6 纯化培养 纯化培养 四 结果分析与评价 1 培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选 出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明 培养基制作合格 如果观察到产生透明圈的菌落 则说明可能获得 了分解纤维素的微生物 2 分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌 的数量 因此最容易分离得到的是细菌 但由于所取 土样的环境不同 不同同学也可能得到真菌和放线菌 等不同的分离结果 为了确定分离得到的是纤维素分解菌 还需要进行 实验 纤维素酶的 发酵方法有 发酵和 发酵 纤 维素酶测定方法
