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1、1结缔组织生长因子特异性结合肽的表达及分离纯化【摘要】 目的：利用基因工程技术获得与结缔组织生长因子（CTGF）特异性结合的小肽。方法：设计并合成带有肠激酶切割位点的基因片段，插入 pET32(a)+质粒载体中硫氧化还原蛋白基因下游，构建重组质粒，转入 E.coli BL21 表达菌中，用终浓度1mmolL-1 的 IPTG 诱导表达融合蛋白；用热变性和硫酸铵分级沉淀对融合蛋白进行初步纯化，然后用亲和层析进一步纯化，经肠激酶切割，最后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽；用反相色谱对所获小肽进行纯度鉴定。结果：所构建的重组质粒测序结果与预期一致；诱导表达后用 SDSPAGE鉴定，发现在相对分子质量
2、20 000处有浓密的表达条带出现，与预期一致；融合蛋白用热变性和硫酸铵分级沉淀进行初步纯化，得率分别为 78.6和 52.3；用亲和层析纯化得率为 50.5；经肠激酶切割后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽，用反相色谱鉴定其纯度大于 95%；最终每升发酵液获得3.4mg 目的肽。结论：成功制备 CTGF 特异性结合肽，为进一步研究该小肽的生物学活性打下基础。 【关键词】 结缔组织生长因子 分离纯化 特异性肽结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是Bradham 等1于 1991 年首次在人的脐静脉内皮细胞培养基中发现2的细胞因子，由 349
3、 个氨基酸残基构成；主要由皮肤成纤维细胞2 、肾小球系膜细胞3、肝星状细胞4、肺成纤维细胞5、血管平滑肌细胞6等合成分泌。CTGF 可以促进细胞增殖、合成胶原，介导细胞黏附78 ，诱导细胞凋亡 911，促进血管形成12，刺激成纤维细胞生长，并参与调节细胞分化、胚胎发育以及伤口愈合，在多种器官和组织纤维化的发生、发展过程中起重要作用。本研究在先前我们用噬菌体展示技术发现 CTGF 特异性结合肽的基础上13，利用基因工程技术制备该小肽，为进一步研究其生物学活性，开发成 CTGF 小分子抑制剂打下基础。1 材料和方法1.1 材料BL21（DE3）HsdS gal(cIts857 indI Sam7
4、nin5 lacUV5T7I)、JM109，本实验室保存； pET32(a)+质粒、肠激酶试剂盒，Novagen 公司；HisSelectTM ，Sigma 公司；SephadexG25, Phamarcia 公司；限制性内切酶 BamH、Xho、EcoR，T4 DNA 连接酶， Promega 公司；胶回收试剂盒，上海生工生物工程技术有限公司；电泳仪，北京六一仪器厂；水平摇床，太仓市光明实验分析仪器厂。31.2 方法1.2.1 目的基因的合成根据我们先前从随机 12 肽库中筛选得到的噬菌体阳性克隆DNA 测序结果，合成一对带有肠激酶位点、编码目的基因（810A）的相互配对的引物 Pa1 和
5、Pa2，用 ddH2O 配成50pmoll-1的引物溶液。PCR 反应体系如下：dNTP（10mmolL-1）0.5l ，10buffer 2.5l， Pa1 和 Pa2 各1l， Taq 酶（10Ul-1 ）0.2l ，最后 ddH2O 补齐至 25l；PCR反应条件：94预变性 5min；94 变性 30s，60 退火30s，72延伸 30s，30 个循环；72延伸 7min，4保温。PCR 产物用 20 gL-1 琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，EB 染色5min，紫外灯下观察并切下目的条带，用凝胶回收试剂盒纯化目的片段。1.2.2 表达载体的构建将含 pET32(a)+质粒的大肠杆菌接种于
6、含氨苄青霉素 (终浓度100gml-1 )的 MHAmp平板上，37 培养过夜。挑取单个菌落，接种于含相同质量终浓度氨苄青霉素的 LB 培养液中，37振摇至 A600 nm 为 0.6，提取 pET32(a)+质粒 DNA，12gL-1 琼4脂糖凝胶电泳观察结果。用限制性内切酶 BamH及 Xho，37酶切 pET32(a)+质粒 DNA 和 PCR 产物 2h，65 20min 灭活。12 gL-1 琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，EB 染色，紫外灯下观察并切下目的条带，用凝胶回收试剂盒进行凝胶回收。在 EP 管中依次加入回收的质粒 DNA10l，目的基因片段 1l，10连接缓冲液1l， T4D
7、NA 连接酶 1l，4 连接过夜。连接产物转化 JM109 感受态细胞，冰上孵育 30min，42热激 90s，加入预热的 LB 培养液 1ml，37水浴 30min，离心将沉淀涂布于含氨苄青霉素(终浓度 100gml-1) MHAmp平板上，37 培养过夜。随机挑选单菌落接种于含氨苄青霉素(终浓度 100 gml-1)的 LB 液体培养液，37震摇 6h，抽提质粒，分别用限制性内切酶 BamH、Xho和 EcoR 酶切，12gL-1 琼脂糖凝胶电泳观察结果。阳性质粒送上海生工生物工程技术有限公司测序，测序引物为 T7 终止子引物。1.2.3 融合蛋白的表达取重组质粒 DNA 5l转化 BL2
8、1(DE3)感受态细胞，37 孵育过夜，挑单菌落扩增后以 1%的接种量转接 250ml 培养基，37 振摇至 A600 nm 为 0.6 0.8，加终浓度为 1mmolL-1 的 IPTG，37诱导 8h。离心收集菌体，在菌体中加入 12ml 含 50mmolL-1TrisHCl、1mmolL-1 EDTA、1mmolL-1 PMSF、320l 10gml-1溶菌酶的混合液，均匀搅拌 30min，15000rmin-145离心 15min，取上清，置于 -20 保存。1.2.4 小肽的分离纯化1.2.4.1 热变性 取破壁上清液，放置于 65 的水中加热，变性杂蛋白，热变性的时间分别为 15、
9、30、60、120 min，12000rmin-1 离心 5min 后，取上清液用 SDSPAGE进行分析，并计算融合蛋白的得率。1.2.4.2 硫酸铵分级沉淀 热变性后的融合蛋白在 25 进行硫酸铵分级沉淀。选取硫酸铵溶液的饱和度为20、30 、40 、 50、60 进行实验；用 50mmolL-1 TrisHCl(pH8.5)溶解后，考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒测定其蛋白含量，用 SDSPAGE进行分析，计算融合蛋白的得率。1.2.4.3 亲和层析 将 HisSelectTM亲和胶装柱，以盐酸胍、EDTA、硫酸镍按操作说明书再生亲和胶；用 2 倍体积 PBS 平衡，将样品加入柱中，流速控制在
10、15mlh-1 左右，用 5 倍体积的 PBS洗涤，流速控制在 100mlh-1 左右。然后分别用 5 倍体积20、100、200mmolL-1 咪唑洗脱，流速控制在 60mlh-1 左右，收集洗脱峰，每管收集 3ml。合并洗脱峰，用 0.01molL-1 pH7.4的 PBS 透析过夜，PEG 20000 浓缩至 2ml 左右。61.2.4.4 肠激酶切割 肠激酶一个单位的定义为：在 20 时，将50g融合蛋白完全切割所需的酶量。按试剂盒说明书的要求加入适量的蛋白、反应缓冲液和酶，SDSPAGE 分析不同时间肠激酶对融合蛋白的切割效率。1.2.4.5 凝胶过滤层析 用 SephedexG25
11、凝胶层析分离小肽，洗脱液为 0.1molL-1pH 7.4 的 PBS，流速为 15mlh-1，分步收集，每管收集 3ml，合并最后洗脱峰，冷冻干燥。1.2.4.6 RPHPLC鉴定纯度 冻干粉用适量蒸馏水溶解，0.22m滤膜过滤后，用 C18Octadecyl 反相色谱柱（BioRad ）进行分析，以含 0.05%三氟乙酸的乙腈水为流动相，乙腈浓度从 595 梯度洗脱，检测波长 225nm。2 结 果2.1 表达载体的构建和鉴定带有肠激酶位点的特异性引物用 PCR 方法合成编码 810A 的DNA 序列， PCR 产物回收后用 BamH+Xho 双酶切，酶切产物与相同酶切的 pET32(a)
12、+相应片段用 T4 连接酶连接，转化 E.coli 7JM109 后提取质粒 DNA，分别用 BamH、Xho 、EcoR进行单酶切，1.2% 琼脂糖凝胶电泳显示，BamH和 Xho 能切割重组质粒，而 EcoR 无酶切（图 1） ，提示外源片段已插入 BamH 和Xho位点之间；测序结果与预期序列一致（测序报告略） 。2.2 融合蛋白的表达重组质粒转化 BL21(DE3)感受态细胞，挑单菌落扩增后用1mmolL-1 的 IPTG 37诱导 8h，用 12% SDSPAGE观察蛋白表达情况。结果显示，约在相对分子质量 20000 处出现浓密的蛋白表达条带，与预期相对分子质量一致（图 2） 。1
13、.Marker；2. 诱导8h 时总蛋白表达；3.诱导 0h 时总蛋白表达2.3 特异性结合肽的分离纯化菌体破碎后上清液经 65热变性，随着时间的延长，杂蛋白逐渐减少，而融合蛋白几乎没有改变。在加热 30min 以后，杂蛋白已无明显变化。用 30%50的硫酸铵进行盐析，结果发现，在 40%饱和度时融合蛋白大部分被沉淀，而其他杂质蛋白在此浓度范围内沉降较少，经考马斯亮蓝测定蛋白含量和凝胶电泳分析，热变性和盐析的融合8蛋白得率分别为 78.6和 52.3（图略） 。用 HisSelectTM亲和层析对融合蛋白粗提液进行纯化，结果显示，用 200mmolL-1 咪唑可以将融合蛋白从柱上洗脱，经SDS
14、PAGE检测其蛋白纯度为 86，融合蛋白的得率为 50.5。用肠激酶对纯化后的融合蛋白进行切割，随着时间的延长，融合蛋白逐渐被切割，至 16h 融合蛋白被完全切割（图 3） 。酶切产物用SephadexG25进行纯化，收集最后一峰，适当浓缩后用RPHPLC进行纯度鉴定，结果在色谱图上显示为单一峰（图 4） ，样品纯度在 95%以上。3 讨 论研究表明，多种信号分子如TGF、Ang 、VEGF、ET1、BMP、IGF 等，通过SMAD、PKC、ROS 、JAK、ERK 等信号通路诱导大多数胶质分子的合成，抑制其降解，并能调节整合素基质受体的表达从而导致组织和器官的纤维化1420 。在所有这些信号
15、机制活化通路中，CTGF 是中心环节，在纤维化的发生和发展过程中起关键作用21。因此,CTGF 是一个更具特异性的靶位，筛选并制备能与 CTGF 特异性结合的小肽具有重要意义。9本研究设计了一对编码 CTGF 特异性结合肽的引物，同时在目的基因的上游引入肠激酶作用位点（DDDDK） ，用 PCR 方法合成带有肠激酶位点的目的基因，并通过 BamH+Xho插入融合蛋白（硫氧化还原蛋白）下游，这样当目的蛋白表达后，用肠激酶切割，就会形成完整、成熟的小肽。肠激酶作用的最适 pH 值为 7.4，本实验中发现，在 pH 值 7.4 条件下进行酶切，融合蛋白会大量析出，导致酶切的效率降低。故实验中选取 pH 8.0 作为酶切条件，并加入一定甘油，摸索在此 pH 值下酶的切割效率，并确定在一定酶量下酶切所需的时间。结果表明，在标准酶量下，随着时间的延长，融合蛋白逐渐被切割，至 16h 融合蛋白被完全切割。以 pET32(a)+载体表达的融合蛋白具有非常好的耐热性，在90以上的水中可以稳定健存 10min，这样既可以初步纯化融合蛋白，除去菌体破碎液中 6070的杂蛋白，同时又变性了菌体破碎液中的蛋白酶，防止蛋白酶对融合蛋白的水解作用。本研究用 65 热变性条件更温和，实验表明能达到理想的去除杂蛋白的效果。尽管亲和层析是目前最有效的分离带 HisTag标签蛋
