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1、1结核杆菌抗原 Ag85B 诱导抗黑素瘤免疫应答及其机制研究作者：吴学忠, 魏海明, 郑晓东 金腾川 田志刚【关键词】 pcDNA3Abstract AIM: To study the antimelanoma immunity efficacy of Ag85B antigen gene therapy in vivo. METHODS: C57BL/6 mice were inoculated s.c. with B16 cells, and 8 days later the mice were inoculated s.c. again with B16 cells (control g
2、roup 1), B16/pcDNA3 cells (control group 2) or B16/pcDNA3Ag85B cells (experimental group), respectively. Tumor volume, survival time, serum IFN level and IL4 level of 3 groups mice were observed. Antitumor activity of Ag85B was studied. RESULTS: From 12 to 23 day, the mean tumor volume of mice incre
3、ased from 1.1058 cm3 and 09123 cm3 to 75983 cm3 and 5.8746 cm3 in the control group 1 and 2, respectively. But it increased from 05158 cm3 to 15080 cm3 in the experimental group. The mean survival time of mice was 241 days and 247 days in the control group 1 and 2, respectively. That was 278 days in
4、 the experimental group. 2Within 13 days after the last inoculation, the serum IFN level of all groups experienced increased (That increased to263ng/L,230ng/L and 25.2ng/L in the control group1,2 and the experimental group, respectively). Subsequently, the serum IFN level in the two control groups d
5、ecreased (That decreased to 193 ng/L and 183 ng/L in the control group 1 and 2) while it still augmented in the experimental group(That increased to 465 ng/L). IL4 level was slightly but not significantly enhanced and then declined in all mice.CONCLUSION: Ag85B induced the increase of serum IFN leve
6、l in the animals experiments, inhibited the tumor growth and prolonged the survival of the tumorbearing mice.KeywordspcDNA3Ag85B; B16 cell; C57BL/6; tumor immunity摘 要 目的: 探讨 Ag85B 在诱发抗黑素瘤免疫应答中的作用, 以及其用于肿瘤免疫治疗的可行性。方法: 经背部皮下接种黑色素瘤细胞株 B16 建立 C57BL/6 小鼠荷瘤模型, 并分为对照 1、 2组和实验组。于荷瘤模型建立后, 对照 1、 2 组经背部皮下分别接种
7、B16 细胞和 B16/pcDNA3 细胞, 实验组背部皮下接种B16/pcDNA3Ag85B 细胞。分别观测 3 组小鼠肿瘤的体积、 生存3时间和血清中的 IFN 及 IL4 的含量。研究 Ag85B 在诱导抗肿瘤免疫应答中的作用。结果: 从 13 d 到 23 d, 对照 1 组和对照 2 组荷瘤小鼠, 肿瘤的平均体积分别从 1.1058 cm3 和 0.9123 cm3 增长到7.5983 cm3 和 5.8746 cm3; 而实验组荷瘤小鼠, 肿瘤的平均体积由 0.5158 cm3 增长到 1.5080 cm3。对照 1 组和对照 2 组荷瘤小鼠的平均生存时间分别为 24.1 d 和
8、24.7 d, 而实验组荷瘤小鼠的平均生存时间为 27.8 d。13 d 内, 两对照组和实验组小鼠血清 IFN的含量均有所上升（对照 1 组、 对照 2 组和实验组分别上升至26.3 ng/L、 23.0 ng/L 和 25.2 ng/L）, 随后两对照组小鼠血清IFN 的含量均呈下降趋势（对照 1 组和对照 2 组分别下降至 19.3 ng/L 和 18.3 ng/L） , 而实验组小鼠血清 IFN 的含量则呈上升趋势（上升至 46.5 ng/L） 。13 d 内, 两对照组和实验组小鼠血清 IL4 的含量均有轻微升高, 随后逐渐下降 , 但 3 组小鼠血清 IL4 含量的变化差异不明显。
9、结论: 接种 B16/pcDNA3Ag85B 细胞的实验组小鼠血清中 IFN 的含量明显增高, 并可抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长, 延长荷瘤小鼠生存的时间。关键词pcDNA3Ag85B; B16 细胞; C57BL/6; 肿瘤免疫Ag85B 是结核杆菌和卡介苗（BCG）主要分泌蛋白 Ag85 复合物中的组分之一。大量动物实验证明, Ag85B 能被 T 细胞表位识别, 并能诱导产生特异性免疫保护1-3, 尤其是可诱导特异性 CTL4的形成4-6。另据文献报道, Ag85B 在分枝杆菌分泌蛋白中的含量占居首位, 其抗原性最强7, 8。为探讨 Ag85B 诱导的抗黑素瘤免疫应答及其机制, 我们在获得
10、被修饰的黑素瘤细胞B16/pcDNA3Ag85B 的基础上, 研究了其诱导抗黑色素瘤的免疫应答及其机制。1 材料和方法1.1 材料 C57BL/6 小鼠, 5 周龄, 雄性, 清洁级, 购自上海实验动物中心。小鼠黑素瘤细胞株 B16 细胞、 小鼠黑素瘤细胞株B16/pcDNA3（用 pcDNA3 转染 B16 细胞筛选出的阳性细胞克隆） 、小鼠黑素瘤细胞株 B16/pcDNA3Ag85B（用 pcDNA3Ag85B 转染 B16 细胞筛选出的阳性细胞克隆）, B16 细胞用自中国科学技术大学生命科学学院免疫学研究所, B16/pcDNA3 和B16/pcDNA3Ag85B 细胞系作者自己建株。
11、小鼠 IFN 和 IL4 ELISA 检测试剂盒购自 Bender 公司。1.2 方法1.2.1 荷瘤小鼠模型的建立 每只 C57BL/6 小鼠背部皮下接种 B16 细胞（ 1105 个）, 8 d 后, 小鼠背部皮下即可长出肿瘤结节。用游标卡尺测量荷瘤块三个方向的直径（cm）, 分别记为 a、 5b 和 c。荷瘤体积（ cm3）的计算公式为: Vabc/69。1.2.2 实验分组 将 36 只 C57BL/6 小鼠于背部皮下接种 B16细胞（1105 个/只）, 8 d 后随机分为 3 组, 即实验组、 对照 1 组及对照 2 组, 每组 12 只。实验组于相同部位再接种 1105 个B16
12、/pcDNA3Ag85B 细胞; 对照 1 组于同一部位再接种 1105 个B16 细胞 , 对照 2 组于同一部位再接种 1105 个 B16/pcDNA3 细胞。于初次接种 B16 细胞之后的第 8 天开始, 观察并测量小鼠背部皮下肿瘤的体积、 记录荷瘤小鼠生存的时间、 摘除小鼠双侧眼球法取血用于 IL4 和 IFN 的检测（除了荷瘤小鼠生存的时间观测之外, 分为 4 个时间点, 即第 8 天、 13 天、 18 天和 23 天, 每个时间点用 3 只小鼠）; 之后每间隔 5 d 一次。荷瘤小鼠背部皮下肿瘤体积的观测、 荷瘤小鼠生存时间的观察、 血清 IFN 水平的检测和 IL4水平的检测
13、, 每个观测项目分别用小鼠 36 只。1.2.3 小鼠血清 IFN 和 IL4 水平的检测 采用 ELISA 检测试剂盒, 严格按试剂盒的说明书进行操作, 检测结果以 ng/L 表示。1.2.4 统计学处理 采用 SPSS10.0 for Windows 软件包进行统计学分析, 组间比较采用 t 检验, 荷瘤小鼠存活时间用生存分析法（寿命表法）分析。2 结果62.1 小鼠背部皮下肿瘤体积的观测 小鼠背部皮下接种1105 个 B16 细胞, 8 d 后经相同部位再分别接种 B16 细胞（对照1 组） 、 B16/pcDNA3 细胞（对照 2 组）和 B16/pcDNA3Ag85B细胞（实验组）
14、。结果表明, 对照 1 组和对照 2 组荷瘤小鼠从1323 d, 肿瘤的体积生长明显加快, 分别从 1.1058 cm3 和0.9123 cm3 增长到 7.5983 cm3 和 5.8746 cm3; 而实验组荷瘤小鼠肿瘤的体积生长比较缓慢, 由 0.5158 cm3 增长到 1.5080 cm3, 与对照组相比较相差显著（P0.05 ） 。2.2 荷瘤小鼠生存时间的观察 对照 1 组、 对照 2 组及实验组荷瘤小鼠的平均生存时间, 分别为 24.1 d、 24.7 d 和 27.8 d。两个对照组荷瘤小鼠的生存时间无统计学意义, 而与实验组荷瘤小鼠的生存时间相比较差别明显（P0.05, 图
15、 1）图 1 各组荷瘤小鼠的存活时间略2.3 血清 IFN 和 IL4 水平的检测 ELISA 法检测表明, 接种不同瘤细胞后, 13 d 内 , 两个对照组和实验组荷瘤小鼠血清中 IFN的含量均有所上升（813 d, 对照 1 组、 对照 2 组和实验组分别由 16.1 ng/L、 15.7 ng/L 和 15.6 ng/L 上升至 26.3 ng/L、 23.0 ng/L 和 25.2 ng/L） , 随后两个对照组小鼠血清 IFN 的含量均呈下7降趋势（23 d, 对照 1 组和对照 2 组分别下降至 19.3 ng/L 和 18.3 ng/L）; 而实验组荷瘤小鼠血清 IFN 的含量则
16、呈上升趋势（ 23 d, 上升至 46.5 ng/L）, 与对照组比较差别显著（P0.05, 图 2） 。血清 IL4 的含量两个对照组和实验组荷瘤小鼠血清 IL4 的水平均略有上升（8 d13 d, 对照 1 组、 对照 2 组和实验组分别由 12.2 ng/L、 10.9 ng/L 和 11.1 ng/L 上升至 19.2 ng/L、 13.5 ng/L和 16.6 ng/L）, 随后逐渐下降（23 d, 对照 1 组、 对照 2 组和实验组分别下降至 9.6 ng/L、 13.5 ng/L 和 9.2 ng/L） 。两个对照组荷瘤小鼠血清 IL4 含量的变化甚微（图 3） 。图 2 图 3 各组荷瘤小鼠血清 IL4 水平的检测略3 讨论AbouZeid 等10研究表明, 结核杆菌表面存在纤连蛋白（FN）受体, 能够与细胞表面的 FN 结合, 黏附于细胞上。当 FN 与菌体相结
