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1、1结核杆菌 Hsp65 和 hGMCSF 双顺反子表达质粒的构建与表达【摘要】 目的：应用分子生物学技术，构建 pIHsp65GM 双顺反子真核表达质粒，并在真核细胞中表达. 方法：以结核分枝杆菌H37Rv 株基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出 Hsp65 基因，同时从质粒 pORFhGMCSF 中扩增出基因佐剂 hGMCSF，分别克隆到真核表达载体 pIRES 的多克隆位点 A（MCSA ）和B（MCSB）中，构建 pIHsp65GM 真核表达质粒，并转染HepG2 细胞中表达和检测 . 结果：酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为 1.64 kb 和 0.47 kb，测序分析表明克隆
2、的 Hsp65 和hGMCSF 序列与 GenBank 上公布序列完全一致；免疫组织化学方法检测到表达 Hsp65 的阳性细胞；ELISA 方法检测到pIHsp65GM 转染组细胞培养上清中 hGMCSF 的表达,与空载体对照组比较差异有统计学意义(P0.01). 结论：成功构建和表达了pIHsp65GM 质粒，为研制优于卡介苗的新型抗结核病 DNA 疫苗奠定基础. 【关键词】 结核分枝杆菌；热休克蛋白 65；人粒巨噬细胞集落刺激因子；双顺反子；基因佐剂0 引言2卡介苗（bacille calmetteguerin, BCG）是已被广泛应用于预防结核病（tuberculosis, TB）的减毒
3、活疫苗. 由于结核 DNA疫苗的制备简便、免疫效果好，目前已经成为 TB 的热门侯选疫苗之一1. 结核杆菌热休克蛋白 65KD 基因（ heat shock protein 65KD, Hsp65）是研究最早的结核抗原之一，可以在动物体内对结核分枝杆菌的感染产生强烈的保护性免疫反应2.粒细胞 吞噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colonystimulating factor, GMCSF)作为良好的基因佐剂, 可以利用其上调机体免疫水平的作用增强 DNA 疫苗的效能3-4. 虽然 Hsp65 抗原和GMCSF 分别在感染免疫中的作用已经被研究证实有效，但对人GM
4、CSF 协同 Hsp65 抗原在结核杆菌感染中的免疫应答特点和保护力尚不清楚5. 我们将两者同时克隆到同一载体上，构建含结核杆菌 Hsp65 和基因佐剂 hGMCSF 的双顺反子真核质粒，旨在为进一步了解结核 DNA 疫苗的免疫效果奠定基础.1 材料和方法1.1 材料结核分枝杆菌 H37Rv 株基因组，大肠杆菌 DH5，载体pIRES 和质粒 pORFhGMCSF(暨南大学医学院微生物学与免疫3学教研室提供)；Ex Taq DNA 聚合酶，T4 DNA 连接酶，限制性内切酶 Nhe I，EcoR I, Xba I 和 Not I，DL1 kb marker，质粒提取试剂盒，DNA 凝胶回收纯化
5、试剂盒( 大连宝生物公司 )；两对 PCR 引物、重组质粒上目的基因的序列测定由上海生工生物工程公司完成；Transmaster 转染试剂（广州博理生物科技公司） ；即用型免疫组化 Biotin SPHRP 试剂盒，DAB 酶底物显色试剂盒（北京鼎国生物科技公司） ；鼠抗人 Hsp65 蛋白单克隆抗体和人 hGMCSF 蛋白ELISA 检测试剂盒（深圳市晶美生物科技公司）.1.2 方法1.2.1 目的基因Hsp65 和 hGMCSF 的 PCR 扩增参照 GenBank 上结核分枝杆菌 H37Rv 株 Hsp65 基因 CDS 序列（NCBI 登陆号：M15467）分别设计引物进行 PCR 扩
6、增.1.2.2pIHsp65 真核载体的构建与鉴定将 Hsp65 的 PCR 产物经过回收纯化后与载体 pIRES，同时用 Nhe I 和 EcoR I 双酶切，酶切后进行 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，并经过凝胶回收纯化试剂盒回收酶切产物，将两者酶切纯化的产物4按照 31 的摩尔比混合，用 T4 DNA 连接酶连接 24 h.转化用低温CaCl2 制备的 E.coli DH5 感受态细菌，然后涂布于含氨苄青霉素50 g/mL 的 LB 固体培养基中 .次日，随机挑取 10 个单菌落，分别接种于 3 mL 含氨苄青霉素的 LB 培养液中， 37 下 150 r/min 振荡培养过夜.先取少量菌
7、液煮沸作为模板进行菌落 PCR 检测是否有Hsp65 的存在，将菌落 PCR 筛选呈阳性的菌落用质粒提取试剂盒抽提质粒 DNA.将提取的质粒 DNA 用 Nhe I 和 EcoR I 双酶切，进行电泳检测，以 DL1 kb marker 为分子量参照， 将筛选出的阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定. 测序采用 Sanger 双脱氧链终止法，对插入序列的两端进行测定， 测序工作由上海生物工程公司完成.1.2.3pIHsp65GM 真核表达质粒的构建与鉴定同构建 pIHsp65 载体方法一样，将hGMCSF 的 PCR 产物经过回收纯化后与载体 pIHsp65 同时用Xba I 和 Not I 双酶切
8、，酶切产物经凝胶回收纯化后，将两者酶切纯化的产物按照 31 的摩尔比混合，用 T4 DNA 连接酶连接 24 h,然后转化感受态细菌 E.coli DH5，涂布于含氨苄青霉素 50 g/mL的 LB 固体培养基中. 次日，随机挑取 10 个单菌落，分别接种于 3 mL 含氨苄青霉素的 LB 培养液中，37下 150 r/min 振荡培养过夜. 将菌落 PCR 筛选呈阳性的菌落用质粒提取试剂盒抽提质粒 DNA.将提取的质粒 DNA 用 Xba I 和 Not I 双酶切，进行电泳检测，以5DL1 kb marker 为分子量参照，将筛选出的阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定.1.2.4 细胞转染取对
9、数生长期的 HepG2 细胞接种在 12 孔板内， 待细胞生长至 70%80 %时， 加入阳离子多聚体转染试剂 Transmaster和质粒 pIHsp65GM 的混合物. 饥饿培养 1 h,加入含 100 mL/L 小牛血清的完全培养基，培养 24 h 后，检测 Hsp65 和 hGMCSF 蛋白的表达.1.2.5Hsp65 蛋白表达的免疫组化检测采用未转染细胞为空白对照和转染了空质粒 pIRES 的细胞为阴性对照，将空质粒 pIRES 和重组质粒 pIHsp65GM 转染HepG2 细胞 48 h,去除培养液,用磷酸盐缓冲盐水 PBS 冲洗.经 40 g/L 的多聚甲醛固定后,依次滴加过氧
10、化酶阻断剂,正常动物非免疫血清,11000 鼠抗人 Hsp65 蛋白抗体,生物素标记二抗和链霉素抗生物素蛋白.最后加入新鲜配制的 DAB 工作液染色,显微镜下观察结果，Hsp65 蛋白的表达以细胞质染呈棕黄色者为阳性 .1.2.6ELISA 法检测6hGMCSF 蛋白表达水平分别收集 pIRES 和质粒pIHsp65GM 转染 24 h 和 48 h 的 HepG2 细胞的细胞培养的上清液，采用 ELISA 双抗体夹心法检测 hGMCSF 蛋白的表达量，按照试剂盒说明进行操作.用酶标仪在吸光度 A450 nm 下测定样品和试剂盒提供的标准品的 A 值.根据标准品所测 A 值绘制的蛋白浓度与A
11、值相关标准曲线计算各样品中 hGMCSF 蛋白的含量( 以空白孔调零).统计学处理：实验数据以 xs 表示，采用 SPSS 13.0 软件包进行分析,组间比较采用两样本 t 检验，P0.05 为差异具有统计学意义.2 结果2.1Hsp65 和 hGMCSF 基因 PCR 扩增产物电泳分析琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR 产物分别为 1.64 kb 和 0.47 kb 的特异性片段，与预期 Hsp65 和 hGMCSF 基因大小相符(图 1).2.2 重组质粒限制性内切酶消化鉴定7质粒 pIHsp65 经 Nhe I 和 EcoR I 双酶切后 ,电泳可见大小约6.1 kb 与 1.64 kb 两
12、片段,与载体 pIRES 经 Nhe I 和 EcoR I 双酶切产物和 Hsp65 基因 PCR 产物的 2 条特异性条带对比,大小相符（图2A）.重组质粒 pIHsp65GM 经 Xba I 和 Not I 双酶切后,电泳可见大小约为 7.74 kb 与 0.47 kb 两片段,与质粒 pIHsp65 经 Xba I 和Not I 双酶切产物和 hGMCSF 基因 PCR 产物的 2 条特异性条带对比, 大小相符（图 2B）.2.3 序列分析鉴定对质粒 pIHsp65 上的多克隆位点 A(multiple cloning sites A,MCSA)内的 DNA 序列进行序列分析鉴定，结果与
13、结核分支杆菌H37Rv 株的 Hsp 65 的基因序列完全相同.对质粒 pIHsp65GM 上的多克隆位点 B(multiple cloning sites B, MCSB)内的 DNA 序列进行序列分析鉴定, 结果与 hGMCSF 的基因序列完全相同.2.4Hsp65 蛋白在 HepG2 细胞中的表达显微镜下观察，与未转染细胞的空白对照和转染空质粒pIRES 细胞的阴性对照对比，pIHsp65GM 转染的部分 HepG2 细胞中胞质染呈棕黄色，表明 Hsp65 表达呈阳性（图 3）.82.5ELISA 检测pIRES 对照组在转染 24 和 48 h 时细胞上清液 hGMCSF 的表达量分别
14、为（1.3710.083） pg/mL 和（1.782 0.127） pg/mL （n=3） ，而 pIHsp65GM 在转染 24 和 48 h 时细胞上清液hGMCSF 的表达量分别为（271.103 4.731） pg/mL 和（253.1243.943）pg/mL；pIHsp65GM 转染组在转染 24 和 48 h 时 hGMCSF 的表达量与 pIRES 对照组比较,差异均有统计学意义（P0.01）.3 讨论近年来，对结核研究最多的抗原主要有 Hsp65,Ag85B, ESAT6 和 MPT64 等6-7.其中 Hsp65 具有免疫优势抗原的特性，能诱导和增强机体的体液免疫和细胞免
15、疫的发生，并可激活 T 细胞, 分泌高水平的 IFN 和杀伤感染的细胞，是人体感染结核杆菌以后免疫系统的主要靶抗原，是 T 细胞攻击的主要对象8. 由于仅含有单抗原基因的 DNA 疫苗并不足以引发良好的免疫效果，还需要结合其他的手段如基因佐剂，特别是将细胞因子与 DNA 疫苗共表达才能产生更强的免疫保护力. GMCSF 作为 DNA 疫苗的免疫佐剂, 能够调节树突状细胞的分化和成熟, 以及 MHC 和共刺激分子的表达水平,并且通过调节抗原提呈细胞尤其是树突状细胞的数量和功9能来调节免疫应答的强度.有研究认为将 GMCSF 作为佐剂与基因疫苗共同免疫小鼠结果比单独应用基因疫苗产生更强烈的细胞免疫
16、应答并可提供更强的免疫保护力3-5.本实验采用载体 pIRES 为双顺反子真核表达质粒，在上下游克隆位点之间的序列为内部核糖体进入位点, 此段序列在转录后能够自动断裂, 使上下游克隆位点插入的基因能够独立高效的表达，从而避免了融合表达蛋白活性低下问题, 为两种蛋白表达、动物实验和结核疫苗研制提供较大方便.与以往结核 DNA 疫苗的研究比较，本实验具有以下特点：实现了目的基因与细胞因子基因在同一载体上共同表达.如果将 DNA疫苗与编码 GMCSF 的质粒混合注射会对 DNA 疫苗的免疫效果产生干扰作用；若将 GMCSF 与目的基因共同克隆到一个载体中，由于两个基因具有相同的局部微环境，往往可以获得较好的免疫效果9.本研究使用双顺反子真核表达载体 pIRES，将两个基因分别克隆到两个多克隆位点，两者各自表达，不相互影响蛋白表达的空间结
