北大现代分子生物学蛋白质工程概论

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1、蛋白质工程概论蛋白质工程概论山东大学医学院生物化学与分子生物学研究所刘贤锡 前言v基因工程诞生基因工程诞生1010周年之际著名科学家周年之际著名科学家Kevin Kevin M.UlmerM.Ulmer于于19831983年在年在SCIENCE(VOL.219)SCIENCE(VOL.219)发表了论文发表了论文 Protein Engineering , ,该文的摘要是该文的摘要是: :vThe prospects for protein engineering ,including the roles of x-ray crystallography,chemical synthesis

2、of DNA ,and computer modeling of protein structure and folding,are discussed.It is now possible to attempt to modify many different properties of proteins by combining information on crystal structure and protein chemistry with artificial gene synthesis.Such techniques offer the potential for alteri

3、ng protein structure and function in ways not possible by any other method.v该文的发表标志着作为生物工程三大技术之一的蛋该文的发表标志着作为生物工程三大技术之一的蛋白质工程诞生了。白质工程诞生了。 v蛋白质工程（蛋白质工程（protein engineeringprotein engineering）研究在）研究在过去的过去的2525年间发展迅速，已取得一批较好成年间发展迅速，已取得一批较好成果，并开始应用于医学、农业、轻工等各个果，并开始应用于医学、农业、轻工等各个领域。领域。v20002000年年6 6月月2626

4、日，人类基因组的工作草图宣告日，人类基因组的工作草图宣告完成，并进入了后基因组时代（完成，并进入了后基因组时代（post-genome post-genome eraera）。）。v后基因组时代，中心任务是揭示基因组及其后基因组时代，中心任务是揭示基因组及其所包含的全部基因的功能，并在此基础上阐所包含的全部基因的功能，并在此基础上阐明生命体的遗传、进化、发育、生长、衰老、明生命体的遗传、进化、发育、生长、衰老、死亡的基本生物学规律，以及与人类健康和死亡的基本生物学规律，以及与人类健康和疾病相关的生物学问题。疾病相关的生物学问题。v由于基因的功能最终是通过其表达产物蛋白由于基因的功能最终是通过其

5、表达产物蛋白质来实现的，因此，在人类基因组测序之后质来实现的，因此，在人类基因组测序之后进一步集中研究蛋白质的结构及功能，是揭进一步集中研究蛋白质的结构及功能，是揭示基因组功能，阐释生命活动规律和生命现示基因组功能，阐释生命活动规律和生命现象本质的基本途径，也是阐释疾病发生与发象本质的基本途径，也是阐释疾病发生与发展的分子机理并进而战胜疾病的重要途径。展的分子机理并进而战胜疾病的重要途径。v研究蛋白质的结构和功能，继而人工改造蛋研究蛋白质的结构和功能，继而人工改造蛋白质的结构，并获得我们所需要的活性蛋白白质的结构，并获得我们所需要的活性蛋白质，正是蛋白质工程的主要任务和目标质，正是蛋白质工程的

6、主要任务和目标。一、蛋白质工程的概念一、蛋白质工程的概念 Protein Engineeringv蛋白质工程是在重组蛋白质工程是在重组DNADNA技术应用于蛋白质结技术应用于蛋白质结构与功能研究之后发展起来的一门新兴学科。构与功能研究之后发展起来的一门新兴学科。v所谓蛋白质工程，就是通过对蛋白质已知结所谓蛋白质工程，就是通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对蛋白质用基因定点诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，产生具有新的特性的蛋结构基因进行改造，产生具有新的特性的蛋白质的技术，并由此深入研究蛋白质

7、的结构白质的技术，并由此深入研究蛋白质的结构与功能的关系。与功能的关系。v蛋白质工程是在遗传工程取得的成就的基础蛋白质工程是在遗传工程取得的成就的基础上，融合蛋白质结晶学、蛋白质动力学、计上，融合蛋白质结晶学、蛋白质动力学、计算机辅助设计和蛋白质化学等学科而迅速发算机辅助设计和蛋白质化学等学科而迅速发展起来的一个新兴研究领域，它开创了按照展起来的一个新兴研究领域，它开创了按照人类意愿设计制造符合人类需要的蛋白质的人类意愿设计制造符合人类需要的蛋白质的新时期，因此，被誉为第二代遗传工程。新时期，因此，被誉为第二代遗传工程。v蛋白质工程的出现，为认识和改造蛋白质分蛋白质工程的出现，为认识和改造蛋白

8、质分子提供了强有力的手段。子提供了强有力的手段。二、蛋白质工程的理论基础二、蛋白质工程的理论基础v（一）工、农业以及医药卫生事业的高速发（一）工、农业以及医药卫生事业的高速发 展为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景展为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景v（二）蛋白质结构与功能关系研究技术的建（二）蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从立推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从而为蛋白质改造提供了理论依据而为蛋白质改造提供了理论依据v（三）基因工程理论和技术的发展，为蛋白（三）基因工程理论和技术的发展，为蛋白质的改造和生产提供了必要的技术手段质的改造和生产提供了必要的

9、技术手段（一）工、农业以及医药卫生事业的高速发展（一）工、农业以及医药卫生事业的高速发展 为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景v1.1.酶的开发利用依赖于蛋白质工程的研发酶的开发利用依赖于蛋白质工程的研发v酶的专一性强，在温和条件下能有效地催化酶的专一性强，在温和条件下能有效地催化化学反应，使酶的应用日益广泛。药品、化化学反应，使酶的应用日益广泛。药品、化学、食品工业及分析服务行业是酶开发的重学、食品工业及分析服务行业是酶开发的重要领地。要领地。v加酶去污剂加酶去污剂: : 洗衣粉、漂白分等；洗衣粉、漂白分等；v医药：链激酶、尿激酶、医药：链激酶、尿激酶、T

10、PATPA等。等。v妨碍酶开发利用的原因主要有：妨碍酶开发利用的原因主要有：v生物材料中酶含量甚少，用传统方法分离纯化酶蛋生物材料中酶含量甚少，用传统方法分离纯化酶蛋白成本太高；白成本太高；v酶蛋白分子结构的稳定性差，过酸、过碱、高温、酶蛋白分子结构的稳定性差，过酸、过碱、高温、氧化等因素可破坏其结构，使其丧失生物活性，因氧化等因素可破坏其结构，使其丧失生物活性，因而在工业加工条件下，酶的半衰期短，利用率低；而在工业加工条件下，酶的半衰期短，利用率低；v酶催化活性的最适酶催化活性的最适pHpH值及底物专一性的范围较窄，值及底物专一性的范围较窄，与工业应用的要求有较大差距。与工业应用的要求有较大

11、差距。v因此，要想扩大酶蛋白的开发利用，需要建立适当因此，要想扩大酶蛋白的开发利用，需要建立适当的方法，以改善酶蛋白的生物特性，使之适合于工的方法，以改善酶蛋白的生物特性，使之适合于工业应用的需求，这就需要利用蛋白质工程对蛋白质业应用的需求，这就需要利用蛋白质工程对蛋白质进行改造。进行改造。v如加酶洗衣粉就是在洗衣粉中加入一种蛋白如加酶洗衣粉就是在洗衣粉中加入一种蛋白水解酶枯草杆菌蛋白酶水解酶枯草杆菌蛋白酶,提高洗衣粉的洗涤效提高洗衣粉的洗涤效果果.但是但是,由于其稳定性较差由于其稳定性较差,最适最适pH值和最适值和最适温度较窄温度较窄,在洗衣机中洗衣服时效果较差在洗衣机中洗衣服时效果较差.经

12、蛋经蛋白质工程改造后大大提高了其应用价值白质工程改造后大大提高了其应用价值,现已现已成为加酶洗衣粉的重要成分成为加酶洗衣粉的重要成分.v2.2.在多肽药物、抗体以及其他活性蛋白质的在多肽药物、抗体以及其他活性蛋白质的基础与应用研究中，同样存在着蛋白质结构基础与应用研究中，同样存在着蛋白质结构的改造问题的改造问题v如白细胞介素如白细胞介素-2-2（IL-2IL-2）是一种免疫反应调）是一种免疫反应调节因子，在医学上具有广泛的用途。结构研节因子，在医学上具有广泛的用途。结构研究证明，究证明，IL-2IL-2是由是由133133个氨基酸残基组成的多个氨基酸残基组成的多肽，有肽，有3 3个半胱氨酸，个

13、半胱氨酸，1 1个二硫键，而个二硫键，而125125位上位上的半胱氨酸处于游离状态的半胱氨酸处于游离状态，在分离纯化，在分离纯化IL-2IL-2的过程中，易发生二硫键错配，致使整个多的过程中，易发生二硫键错配，致使整个多肽活性降低。肽活性降低。v定点诱变将编码链上编码定点诱变将编码链上编码125125位半胱氨酸的密位半胱氨酸的密码子码子TGTTGT转换成丝氨酸或丙氨酸的密码转换成丝氨酸或丙氨酸的密码(TCT(TCT或或GCA)GCA)，结果可以避免二硫键的错配，使产品，结果可以避免二硫键的错配，使产品IL-2IL-2的活性的活性提高了提高了7 7倍倍。v再如再如: :单克隆抗体是很有希望的疾病

14、治疗用药单克隆抗体是很有希望的疾病治疗用药, ,但是但是, ,单克隆抗体技术建立起已有数十年单克隆抗体技术建立起已有数十年, ,并并早已认识到其药用价值早已认识到其药用价值, ,但至今应用不佳但至今应用不佳, ,原原因是鼠源单抗对人来说是异体蛋白。其人源因是鼠源单抗对人来说是异体蛋白。其人源化改造需蛋白质工程才能完成。化改造需蛋白质工程才能完成。v可见，改造蛋白质的空间结构以改变蛋白质可见，改造蛋白质的空间结构以改变蛋白质的某些生物学特性，在拓宽蛋白质的用途，的某些生物学特性，在拓宽蛋白质的用途，推动生物技术产业化方面至关重要。而蛋白推动生物技术产业化方面至关重要。而蛋白质精细结构的改造，只有

15、利用蛋白质工程技质精细结构的改造，只有利用蛋白质工程技术才能得以实现。术才能得以实现。（二）蛋白质结构与功能关系研究技术的建立（二）蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从而为推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从而为蛋白质改造提供了理论依据蛋白质改造提供了理论依据v蛋白质工程的重要目标之一，是通过改造蛋白质的蛋白质工程的重要目标之一，是通过改造蛋白质的结构来提高其开发利用的价值。这就是说，蛋白质结构来提高其开发利用的价值。这就是说，蛋白质的结构改变了，其生物学功能不能变。的结构改变了，其生物学功能不能变。v研究表明，蛋白质功能部位的几个氨基酸残基决定研究表明，蛋白

16、质功能部位的几个氨基酸残基决定着蛋白质的功能，但是这几个负责功能的氨基酸残着蛋白质的功能，但是这几个负责功能的氨基酸残基必须处于一个极其精密的空间状态下才能发挥功基必须处于一个极其精密的空间状态下才能发挥功能。只有能维持蛋白质结构域的必须氨基酸及其空能。只有能维持蛋白质结构域的必须氨基酸及其空间构象不变，其功能域的生物学活性才会保持不变。间构象不变，其功能域的生物学活性才会保持不变。v因此在对蛋白质进行改造之前必需对其结构与功能因此在对蛋白质进行改造之前必需对其结构与功能的关系进行充分地研究，了解影响蛋白质特性的氨的关系进行充分地研究，了解影响蛋白质特性的氨基酸或氨基酸序列是哪些？改变这个（些

17、）氨基酸基酸或氨基酸序列是哪些？改变这个（些）氨基酸是否会影响蛋白质的功能？是否会影响蛋白质的功能？v阐明蛋白质的三维结构，进而研究其与生物学功能阐明蛋白质的三维结构，进而研究其与生物学功能的关系已成为了解生命现象的关键，并成为蛋白质的关系已成为了解生命现象的关键，并成为蛋白质工程的基础。工程的基础。v蛋白质结构与功能关系研究技术主要包括蛋白质晶蛋白质结构与功能关系研究技术主要包括蛋白质晶体学、蛋白质动力学、生物信息学等。体学、蛋白质动力学、生物信息学等。v1蛋白质晶体学蛋白质晶体学v蛋白质晶体学（蛋白质晶体学（protein crystallographyprotein crystallog

18、raphy）是利用是利用X X射线衍射法（射线衍射法（X-ray diffraction X-ray diffraction methodmethod）的原理解释蛋白质晶体中的原子在）的原理解释蛋白质晶体中的原子在空间的位置与排列，并了解其与功能的关系。空间的位置与排列，并了解其与功能的关系。v2020世纪世纪5050年代末用年代末用X X射线晶体学方法测定了第射线晶体学方法测定了第一个蛋白质一个蛋白质肌红蛋白的结构肌红蛋白的结构. .v现已有现已有400400多种蛋白质的三维结构被搞清。多种蛋白质的三维结构被搞清。v通过蛋白质三维结构的研究有助于了解蛋白通过蛋白质三维结构的研究有助于了解蛋白

19、质是如何发挥生物学功能的。质是如何发挥生物学功能的。v近年来又发展了近年来又发展了核磁共振（核磁共振（NMRNMR）技术）技术，它是，它是确定蛋白质分子在溶液中结构信息广为使用确定蛋白质分子在溶液中结构信息广为使用的方法。核磁共振技术使用较低强度辐射能的方法。核磁共振技术使用较低强度辐射能测定蛋白质分子在流动化液态下的三维结构测定蛋白质分子在流动化液态下的三维结构信息，从而更真实地反映蛋白质在生物环境信息，从而更真实地反映蛋白质在生物环境下的结构信息，并能确定小分子与大分子复下的结构信息，并能确定小分子与大分子复合物的结构。合物的结构。v2蛋白质动力学蛋白质动力学v线性多肽是如何折叠成具有三维

20、特征的天然结构？线性多肽是如何折叠成具有三维特征的天然结构？蛋白质在与其他物质（蛋白质、核酸或酶的底物等）蛋白质在与其他物质（蛋白质、核酸或酶的底物等）相互作用时，其三维结构又是经历怎样的动态过程相互作用时，其三维结构又是经历怎样的动态过程而发挥其活性？只有了解这些问题，才能预测基因而发挥其活性？只有了解这些问题，才能预测基因水平的改造最终会对蛋白质结构与功能产生何种后水平的改造最终会对蛋白质结构与功能产生何种后果，才能谈得上具有真正意义的分子设计，才能真果，才能谈得上具有真正意义的分子设计，才能真正的理解生命现象。蛋白质动力学正是研究这一课正的理解生命现象。蛋白质动力学正是研究这一课题的。题

21、的。 v3.生物信息学生物信息学v生物信息学生物信息学的神速发展为蛋白质动力学的研究提供的神速发展为蛋白质动力学的研究提供了方便有效的技术。了方便有效的技术。v生物信息学是利用计算机控制的生物信息学是利用计算机控制的图像显示系统图像显示系统，把，把所要研究蛋白质的已知三维结构显示在屏幕上，分所要研究蛋白质的已知三维结构显示在屏幕上，分析哪些残基对析哪些残基对分子内分子内相互作用可能是重要的，哪些相互作用可能是重要的，哪些残基对残基对分子间分子间相互作用可能是重要的。前者通常为相互作用可能是重要的。前者通常为结构的稳定所必需，后者多系分子识别及活性重要结构的稳定所必需，后者多系分子识别及活性重要

22、部位。部位。v然后通过计算机按预先设想替换一些侧链基团，再然后通过计算机按预先设想替换一些侧链基团，再用计算机寻找经过用计算机寻找经过“微扰微扰”后蛋白质分子的能量趋后蛋白质分子的能量趋于极小的状态，预测由于这种替换可能造成的后果。于极小的状态，预测由于这种替换可能造成的后果。v生物信息学是蛋白质工程研究必不可少的。目前已生物信息学是蛋白质工程研究必不可少的。目前已有蛋白质结构与特性分析所需的生物信息数据库，有蛋白质结构与特性分析所需的生物信息数据库，可供选择。可供选择。（三）基因工程理论和技术的发展，为蛋（三）基因工程理论和技术的发展，为蛋白质的改造和生产提供了必要的技术手段白质的改造和生产

23、提供了必要的技术手段v1.基因克隆、表达与纯化技术的成熟为提高基因克隆、表达与纯化技术的成熟为提高蛋白质得率提供了重要技术策略蛋白质得率提供了重要技术策略v随着基因工程理论和技术的发展，人们已经随着基因工程理论和技术的发展，人们已经能克隆特异蛋白质的基因，并令其在适宜宿能克隆特异蛋白质的基因，并令其在适宜宿主菌中表达，使蛋白质的产量大大提高，因主菌中表达，使蛋白质的产量大大提高，因而降低蛋白质纯化成本的问题已基本解决。而降低蛋白质纯化成本的问题已基本解决。重要的问题是提高酶蛋白的稳定性，改良其重要的问题是提高酶蛋白的稳定性，改良其生物学特性。生物学特性。v2.2.定点诱变技术的建立定点诱变技术

24、的建立为改造蛋白质的特性为改造蛋白质的特性提供了技术策略提供了技术策略v稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋白质分子众多基团间的稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋白质分子众多基团间的相互作用，如相互作用，如肽键、氢键、静电作用、肽键、氢键、静电作用、疏水残基间的疏水残基间的疏水键疏水键以及以及二硫键二硫键等。等。v研究表明，上述稳定蛋白质空间构象的因素是由蛋白质一级研究表明，上述稳定蛋白质空间构象的因素是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的，人工改变或修饰结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的，人工改变或修饰这些氨基酸残基，有可能增加蛋白质的稳定性，又不影响其这些氨基酸残基，有可能增加蛋白

25、质的稳定性，又不影响其生物学活性。生物学活性。v如野生型枯草杆菌蛋白酶的如野生型枯草杆菌蛋白酶的218218位天冬酰胺位天冬酰胺( (AsnAsn) )是酶活性部位有关的氨基酸残基，若将是酶活性部位有关的氨基酸残基，若将其变成其变成丝氨酸丝氨酸(Ser)(Ser)，用，用6565的失活半衰期衡的失活半衰期衡量，从量，从5959分钟增到分钟增到223223分钟，酶的稳定性显著分钟，酶的稳定性显著增加。增加。v再如氧化失活使枯草杆菌蛋白酶在工业上的再如氧化失活使枯草杆菌蛋白酶在工业上的应用受到严重限制。应用受到严重限制。v枯草杆菌蛋白酶在少量枯草杆菌蛋白酶在少量H H2 2O O2 2作用下很快失

26、活是作用下很快失活是由于埋藏在催化部位由于埋藏在催化部位Ser221Ser221邻近的邻近的Met222Met222氧氧化成硫氢化物的原因化成硫氢化物的原因。v19851985年年WellsWells证明若用其他氨基酸取代证明若用其他氨基酸取代Met222Met222，可以提高酶的氧化稳定性而又保持高催化，可以提高酶的氧化稳定性而又保持高催化活性活性。v目前我们已经能对蛋白质的结构进行改造，目前我们已经能对蛋白质的结构进行改造，甚至于能制造出全新的蛋白质，这得益于分甚至于能制造出全新的蛋白质，这得益于分子生物学理论与技术的发展。子生物学理论与技术的发展。v2020世纪世纪7070年代初期，年代

27、初期，DNADNA重组技术诞生，并成重组技术诞生，并成功地应用于基因操作，从而产生了基因工程。功地应用于基因操作，从而产生了基因工程。v而基因工程的诞生，而基因工程的诞生，特别是特别是DNADNA重组技术和定重组技术和定点诱变技术的建立点诱变技术的建立，使我们有可能从基因水，使我们有可能从基因水平改造蛋白质分子中氨基酸的序列，为蛋白平改造蛋白质分子中氨基酸的序列，为蛋白质工程的诞生，奠定了技术基础。质工程的诞生，奠定了技术基础。v所谓所谓基因定点诱变基因定点诱变（site-directed mutagenesissite-directed mutagenesis），），就是在就是在DNADNA

28、水平上，在体外试管中通过碱基取代、插水平上，在体外试管中通过碱基取代、插入或缺失改变基因入或缺失改变基因DNADNA序列中任何一个（或几个）特序列中任何一个（或几个）特定的碱基，使蛋白质结构基因中某个或某些氨基酸定的碱基，使蛋白质结构基因中某个或某些氨基酸编码顺序加以改变，从而改变蛋白质结构的技术。编码顺序加以改变，从而改变蛋白质结构的技术。v该技术具有简单易行重复性高等优点。它适用于该技术具有简单易行重复性高等优点。它适用于: :v基因结构与功能的研究，基因结构与功能的研究，v通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，v用于确定蛋白质中每一个氨基酸在结构和功

29、能上的用于确定蛋白质中每一个氨基酸在结构和功能上的作用，为人工改造蛋白质提供理论依据。作用，为人工改造蛋白质提供理论依据。v寡核苷酸定点诱变技术所依据的原理是寡核苷酸定点诱变技术所依据的原理是: :v按照体外按照体外DNADNA重组技术，将待诱变的目的基因插入到重组技术，将待诱变的目的基因插入到M13M13噬菌体上，制备此种含有目的基因的噬菌体上，制备此种含有目的基因的M13M13单链单链DNADNA，即正链，即正链DNADNA。v再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动单链作引物，启动单链DNADNA分子进行复制，随后这段寡核分子进

30、行复制，随后这段寡核苷酸引物更新成为新合成的苷酸引物更新成为新合成的DNADNA子链的一个组成部分。子链的一个组成部分。因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列，因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列，经表达即可获得改造后的蛋白质。经表达即可获得改造后的蛋白质。v为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。则与目的基因编码链的特定区段完全互补。定点诱变原理示意图v总之，蛋白质结构和动力学研究是蛋白质结总之，蛋白质结构和动

31、力学研究是蛋白质结构与功能关系研究的重要手段，而改造蛋白构与功能关系研究的重要手段，而改造蛋白质结构，则依靠基因工程，基因工程的发展质结构，则依靠基因工程，基因工程的发展从技术上提供了改变蛋白质个别氨基酸残基从技术上提供了改变蛋白质个别氨基酸残基或肽段的手段，使结构改变已能在实验室实或肽段的手段，使结构改变已能在实验室实施，二者结合则产生了蛋白质工程。施，二者结合则产生了蛋白质工程。三、蛋白质工程的研究内容蛋白质工程的研究内容v（一）利用已知蛋白质一级结构的信息作为（一）利用已知蛋白质一级结构的信息作为应用研究应用研究v（二）定量蛋白质结构与功能关系的研究（二）定量蛋白质结构与功能关系的研究v

32、（三）根据已知结构（三）根据已知结构-功能的关系人工改造蛋功能的关系人工改造蛋白质白质（一）利用已知蛋白质一级结构的信（一）利用已知蛋白质一级结构的信息作为应用研究息作为应用研究 v蛋白质的结构决定蛋白质的功能和理化性质，而蛋蛋白质的结构决定蛋白质的功能和理化性质，而蛋白质功能区的某个或某些氨基酸残基可能在维持蛋白质功能区的某个或某些氨基酸残基可能在维持蛋白质的结构、功能、理化性质中起重要作用。白质的结构、功能、理化性质中起重要作用。v因此，定点改变这些氨基酸序列，即可能改变蛋白因此，定点改变这些氨基酸序列，即可能改变蛋白质的功能和特性，使之更适合于工业化生产的要求。质的功能和特性，使之更适合

33、于工业化生产的要求。v如前所述枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是如前所述枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的由于催化部位的Ser221Ser221邻近的邻近的Met222Met222易被氧化成硫易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代氢化物，若以其他氨基酸取代Met222Met222，则可提高酶，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。析和定点突变改造蛋白质的成功范例。 （二）定量研究蛋白质结构与功能的关系（二）定量研究蛋白质结构与功能的关系v这是目前蛋白质工程研究的主体。这一类研这是目前

34、蛋白质工程研究的主体。这一类研究的课题很广泛，包括蛋白质三维结构模型究的课题很广泛，包括蛋白质三维结构模型的建立，配体结合和酶催化的性质，蛋白质的建立，配体结合和酶催化的性质，蛋白质折叠和稳定性研究，蛋白质变异等等。这类折叠和稳定性研究，蛋白质变异等等。这类研究看起来偏重理论，但对于指导实际工程研究看起来偏重理论，但对于指导实际工程意义重大。意义重大。（三）根据已知结构（三）根据已知结构-功能关系人工改造蛋白质功能关系人工改造蛋白质v蛋白质工程是研究蛋白质结构和定点改造蛋蛋白质工程是研究蛋白质结构和定点改造蛋白质结构的一门学科，白质结构的一门学科，其创造性成就在于开其创造性成就在于开创了按照人

35、类意愿设计制造符合人类需要的创了按照人类意愿设计制造符合人类需要的蛋白质的新时期。蛋白质的新时期。根据蛋白质结构和功能的根据蛋白质结构和功能的关系，采用基因定点诱变技术，人工改造蛋关系，采用基因定点诱变技术，人工改造蛋白质则是蛋白质工程的主要研究内容之一。白质则是蛋白质工程的主要研究内容之一。其主要研究内容如下：其主要研究内容如下：通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物功效及独立工作的能力功效及独立工作的能力v用定点诱变技术不仅可以提高蛋白质的稳定用定点诱变技术不仅可以提高蛋白质的稳定性，还可以提高酶的活性。要改变酶的活性，性，还可以提高酶的活性。要改变酶的活

36、性，需要一个详细描述了酶的活性位点的图谱。需要一个详细描述了酶的活性位点的图谱。有了这样的资料，研究者们即可推测酶与底有了这样的资料，研究者们即可推测酶与底物的亲和程度，并利用定点诱变技术对蛋白物的亲和程度，并利用定点诱变技术对蛋白质进行改造，提高酶的活性。质进行改造，提高酶的活性。v表表44 天然和诱变酪氨酰天然和诱变酪氨酰-tRNA合成酶活性合成酶活性v酶酶 Kcat(s-1) Km(mmol/L) Kcat/Km(s-1mol-1)vThr-51 4.7 2.5 1.860vAla-51 4.0 1.2 3.200vPro-51 1.8 0.019 95.800通过改变蛋白质的结构顺序，

37、提高其在极端条通过改变蛋白质的结构顺序，提高其在极端条件（如酸、碱、热等）下的稳定性；例如件（如酸、碱、热等）下的稳定性；例如:v蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基（SHSH）之间氧化脱氢即形成二硫键（）之间氧化脱氢即形成二硫键（）。）。v二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高蛋白质分子蛋白质分子中的二硫键，可提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。v在一项研究中，通过寡核苷酸定点诱变构建在一项研究中，通过寡核苷酸定点诱变构建了了T4T4

38、溶菌酶的六种变异体溶菌酶的六种变异体, ,比较了它们的活性比较了它们的活性. .v表表41 T4溶菌酶和溶菌酶和6种设计的变体特性种设计的变体特性v酶酶 氨基酸的位置氨基酸的位置 二硫键的数目二硫键的数目 相对活性相对活性 Tmv 3 9 21 54 97 142 164 (%) ()vwt Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu 0 100 41.9vpwt Ile Ile Thr Thr Ala Thr Leu 0 100 41.9vA Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu 1 96 46.7vB Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1

39、 106 48.3vC Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1 0 52.9vD Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2 95 57.6vE Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2 0 58.9vF Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys 3 0 65.9vwt：野生型：野生型T4溶菌酶；溶菌酶；pwt:假野生型酶；假野生型酶；AF：六种设计的半胱氨酸：六种设计的半胱氨酸变体；变体；Tm:熔点温度熔点温度通过改变蛋白质的结构顺序通过改变蛋白质的结构顺序使其便于分离纯化使其便于分离纯化v这项研究虽然难度较大，但随着人类基

40、因组这项研究虽然难度较大，但随着人类基因组研究、后基因组研究的不断深入和完善，随研究、后基因组研究的不断深入和完善，随着蛋白质工程研究技术和手段的不断发展，着蛋白质工程研究技术和手段的不断发展，该项研究必将获得丰硕的成果。该项研究必将获得丰硕的成果。四、蛋白质工程的基本程序四、蛋白质工程的基本程序v蛋白质工程是从蛋白质工程是从DNADNA的水平改变基因入手，设计合成的水平改变基因入手，设计合成或改造蛋白质的技术。或改造蛋白质的技术。v该技术综合运用蛋白质的三维结构，结构与功能关该技术综合运用蛋白质的三维结构，结构与功能关系的详细信息，用定点诱变基因的方法直接修饰改系的详细信息，用定点诱变基因的

41、方法直接修饰改变基因，或人工合成基因，从而定向改变蛋白质的变基因，或人工合成基因，从而定向改变蛋白质的结构，使其成为具有人们所希望性能的新型蛋白质，结构，使其成为具有人们所希望性能的新型蛋白质，或者创造自然界不存在的蛋白质。或者创造自然界不存在的蛋白质。 蛋白质工程的程序蛋白质工程的程序v分离纯化分离纯化0.11.0mg0.11.0mg纯蛋白质，纯蛋白质，v测定其部分肽段一段结构，根据编码原则合成相应测定其部分肽段一段结构，根据编码原则合成相应同位素标记的寡苷酸探针同位素标记的寡苷酸探针; ;v以此从基因库中分离编码该蛋白质的克隆化基因，以此从基因库中分离编码该蛋白质的克隆化基因，转入噬菌体转

42、入噬菌体M13M13系统，用双脱氧末端终止法进行系统，用双脱氧末端终止法进行DNADNA序列分析序列分析; ;v通过表达载体获得较大量通过表达载体获得较大量(0.11.0(0.11.0克克) )该蛋白质用于该蛋白质用于空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机提出空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机提出分子预测性质及改造方案分子预测性质及改造方案; ;v通过寡核苷酸通过寡核苷酸M13M13系统定点诱变并分离其突变体，引系统定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化多量突变性蛋白质，分析其入表达载体生产并纯化多量突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质性质指导进一步

43、分子设计，以最终获得所预期性质的分子。的分子。五、五、 蛋白质工程的应用蛋白质工程的应用v（一）研究蛋白质结构与功能的关系（一）研究蛋白质结构与功能的关系v（二）改变蛋白质的特性（二）改变蛋白质的特性v（三）生产蛋白质和多肽类活性物质（三）生产蛋白质和多肽类活性物质v（四）设计合成全新蛋白质（四）设计合成全新蛋白质（一）研究蛋白质结构与功能的关系（一）研究蛋白质结构与功能的关系v研究蛋白质结构与功能的关系是按照人类的研究蛋白质结构与功能的关系是按照人类的意愿改造蛋白质的特性、产业化生产活性蛋意愿改造蛋白质的特性、产业化生产活性蛋白质、甚至设计和制造全新蛋白质的基础。白质、甚至设计和制造全新蛋白

44、质的基础。v而蛋白质工程则为研究蛋白质结构与功能的而蛋白质工程则为研究蛋白质结构与功能的关系提供了必要的理论和技术，使我们有可关系提供了必要的理论和技术，使我们有可能利用基因工程技术研究蛋白质的结构与功能利用基因工程技术研究蛋白质的结构与功能的关系。能的关系。（二）改变蛋白质的特性（二）改变蛋白质的特性v蛋白质工程的建立，使人们有可能通过改造蛋白质工程的建立，使人们有可能通过改造蛋白质的结构来改变蛋白质的生物学特性。蛋白质的结构来改变蛋白质的生物学特性。v如改变酶的催化活性、酶对底物的专一性、如改变酶的催化活性、酶对底物的专一性、酶与配体的结合能力、酶在酶与配体的结合能力、酶在pHpH变化、温

45、度变变化、温度变化以及溶剂系统变化条件下分子结构的稳定化以及溶剂系统变化条件下分子结构的稳定性等等。这些都可以通过蛋白质工程将酶分性等等。这些都可以通过蛋白质工程将酶分子中某个或某一段氨基酸残基更换、增加、子中某个或某一段氨基酸残基更换、增加、删除或修饰来实现。删除或修饰来实现。v如前所述枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是如前所述枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的由于催化部位的Ser221Ser221邻近的邻近的Met222Met222易被氧化成硫易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代氢化物，若以其他氨基酸取代Met222Met222，则可提高酶，则可提高酶的氧化稳定性而又不

46、影响其催化活性。这是结构分的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。析和定点突变改造蛋白质的成功范例。v枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其只能水解只能水解笨丙氨酸笨丙氨酸PhePhe羧基羧基所形成的肽键，底物作用所形成的肽键，底物作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正电荷范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正电荷的的赖氨酸赖氨酸LysLys取代位于活性中心取代位于活性中心166166位的位的甘氨酸甘氨酸GlyGly，所获得的突变酶不仅能水解所获得的突变酶不仅能水解PhePhe羧基所形成的肽键，羧基

47、所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸而且可以水解酸性氨基酸谷氨酸谷氨酸GluGlu所形成的肽键，所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点诱变改变蛋白质生物学活性涤剂添加酶，这是定点诱变改变蛋白质生物学活性的成功例子。的成功例子。（三）生产蛋白质和多肽类活性物质（三）生产蛋白质和多肽类活性物质v1提高酶的产量和创建新型酶提高酶的产量和创建新型酶v天然酶的产量低、稳定性差，限制了酶的开发利用。天然酶的产量低、稳定性差，限制了酶的开发利用。DNADNA重组技术对酶工业的渗透，导致了酶工业的迅速重组技术对酶工业的渗透，导

48、致了酶工业的迅速发展。目前已有多种酶实现了克隆化，并在适宜宿发展。目前已有多种酶实现了克隆化，并在适宜宿主菌中表达成功，从而极大地提高了酶的产量。主菌中表达成功，从而极大地提高了酶的产量。v蛋白质工程技术的兴起，给创建新型酶、改变酶的蛋白质工程技术的兴起，给创建新型酶、改变酶的生理特性提供了强有力的工具。如利用基因定点诱生理特性提供了强有力的工具。如利用基因定点诱变技术，将变技术，将T4T4溶菌酶的溶菌酶的第第3 3位异亮氨酸位异亮氨酸变成变成半胱氨酸半胱氨酸，后者与第后者与第9797位的半胱氨酸形成二硫键位的半胱氨酸形成二硫键，从而稳定了，从而稳定了两个结构域所形成的活性中心，使酶在高温下的

49、稳两个结构域所形成的活性中心，使酶在高温下的稳定性大大提高。如果将该酶的定性大大提高。如果将该酶的第第5151位苏氨酸位苏氨酸换成换成脯脯氨酸氨酸，可使酶的活性，可使酶的活性提高提高2525倍倍。 v2设计和研制新型抗体设计和研制新型抗体v传统的抗体是经过抗原免疫动物获得的，称为传统的抗体是经过抗原免疫动物获得的，称为多克多克隆抗体隆抗体。19751975年，年，KohlerKohler及及MilsteinMilstein等通过杂交瘤等通过杂交瘤技术制备了技术制备了单克隆抗体单克隆抗体，这是免疫学上划时代的伟，这是免疫学上划时代的伟大进展之一。单抗用于临床疾病治疗，效果不尽人大进展之一。单抗用

50、于临床疾病治疗，效果不尽人意，原因在于目前用于治疗的单抗多为小鼠单抗，意，原因在于目前用于治疗的单抗多为小鼠单抗，对人而言是一种异体蛋白，对人而言是一种异体蛋白，会引起人产生人抗鼠抗会引起人产生人抗鼠抗体体（human anti-mouse antibodies , HAMAhuman anti-mouse antibodies , HAMA），此），此时再使用小鼠单抗，时再使用小鼠单抗，HAMAHAMA与小鼠单抗结合后，不但与小鼠单抗结合后，不但会中和单抗使之失效，还会产生有害的过敏反应。会中和单抗使之失效，还会产生有害的过敏反应。为解决这一问题，人们应用基因工程等手段进一步为解决这一问题，

51、人们应用基因工程等手段进一步研究抗体的结构与功能的关系，并对抗体基因进行研究抗体的结构与功能的关系，并对抗体基因进行改造，制备出了第三代抗体改造，制备出了第三代抗体基因工程抗体基因工程抗体（genetic engineering antibody , genetic engineering antibody , GeAbGeAb），使抗），使抗体的制备更加简化，并且拓宽了抗体的应用范围。体的制备更加简化，并且拓宽了抗体的应用范围。v基因工程抗体技术主要包括两部分内容基因工程抗体技术主要包括两部分内容：v对已有的单克隆抗体进行改造，包括单抗的对已有的单克隆抗体进行改造，包括单抗的人源化、小分子抗

52、体以及抗体融合蛋白的制人源化、小分子抗体以及抗体融合蛋白的制备；备；v通过抗体库的构建，使得抗体不需抗原免疫通过抗体库的构建，使得抗体不需抗原免疫即可筛选并克隆新的单抗。运用蛋白质工程即可筛选并克隆新的单抗。运用蛋白质工程技术对抗体进行改造，被称为技术对抗体进行改造，被称为抗体工程抗体工程，主，主要包括要包括嵌合抗体嵌合抗体、重构抗体重构抗体、单链抗体单链抗体、单单区抗体区抗体及新近出现的全套抗体的研究。及新近出现的全套抗体的研究。v3设计和研制多肽及蛋白质类药物设计和研制多肽及蛋白质类药物v随着蛋白质工程技术的建立和发展，医药生随着蛋白质工程技术的建立和发展，医药生物高科技产品也迅速发展。当

53、前，人们不仅物高科技产品也迅速发展。当前，人们不仅可以利用基因克隆和表达技术，使可以应用可以利用基因克隆和表达技术，使可以应用与临床的微量蛋白质（如胰岛素、干扰素、与临床的微量蛋白质（如胰岛素、干扰素、某些酶类等）得以产业化生产，而且可以应某些酶类等）得以产业化生产，而且可以应用蛋白质工程用蛋白质工程“重新设计重新设计”的思想，以的思想，以DNADNA重重组技术为手段，对多肽和蛋白质类药物的结组技术为手段，对多肽和蛋白质类药物的结构加以改造，以期更好地解决蛋白质类药物构加以改造，以期更好地解决蛋白质类药物的导向性问题。的导向性问题。v目前已能产业化生产并应用于临床治疗的基目前已能产业化生产并应

54、用于临床治疗的基因工程药物有激素类及神经递质类药物、细因工程药物有激素类及神经递质类药物、细胞因子类药物、酶类药物及凝血因子等不同胞因子类药物、酶类药物及凝血因子等不同类别的多种药物。基因工程药物是目前国内类别的多种药物。基因工程药物是目前国内外发展较快的一个产业，同时也使人类疾病外发展较快的一个产业，同时也使人类疾病的防治水平得到了提高。的防治水平得到了提高。v如重组胰岛素的生产如重组胰岛素的生产. .v4设计合成全新蛋白质设计合成全新蛋白质v根据蛋白质结构与功能关系的研究结果，利用计算根据蛋白质结构与功能关系的研究结果，利用计算机对信息进行分析，通过实验，即可设计出一种预机对信息进行分析，

55、通过实验，即可设计出一种预定空间结构的全新多肽和蛋白质分子，再利用基因定空间结构的全新多肽和蛋白质分子，再利用基因重组、基因克隆和基因表达技术即可制造出具有全重组、基因克隆和基因表达技术即可制造出具有全新化学性质、生物学活性的蛋白质。新化学性质、生物学活性的蛋白质。v全新蛋白质的设计合成是一项十分复杂的工作，目全新蛋白质的设计合成是一项十分复杂的工作，目前虽已有人报道已合成某种模拟蛋白质，但仍处于前虽已有人报道已合成某种模拟蛋白质，但仍处于实验初级阶段。相信，随着蛋白质工程技术的发展，实验初级阶段。相信，随着蛋白质工程技术的发展，设计合成全新蛋白质的工作，也会获得突破性的进设计合成全新蛋白质的

56、工作，也会获得突破性的进展。展。六、蛋白质工程展望六、蛋白质工程展望v蛋白质工程是蛋白质工程是2020世纪世纪8080年代初诞生的一个新年代初诞生的一个新兴领域，其主要内容是将核酸研究与蛋白质兴领域，其主要内容是将核酸研究与蛋白质研究相结合，通过有控制的基因修饰和改造，研究相结合，通过有控制的基因修饰和改造，产生符合人们意愿的蛋白质。另一项更为新产生符合人们意愿的蛋白质。另一项更为新颖的战略是利用蛋白质组合规律及结构与功颖的战略是利用蛋白质组合规律及结构与功能关系方面的研究结果设计新的蛋白质。能关系方面的研究结果设计新的蛋白质。v现阶段蛋白质工程急待解决的一个主要现阶段蛋白质工程急待解决的一个

57、主要问题是问题是发展克隆基因的表达方法发展克隆基因的表达方法，即找，即找到理想的宿主表达系统。目前常用的表到理想的宿主表达系统。目前常用的表达系统有细菌表达系统、酵母表达系统、达系统有细菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞等，这些昆虫表达系统、哺乳动物细胞等，这些表达系统各有优缺点。表达系统各有优缺点。细菌表达系统细菌表达系统v细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本低成本低; ;v但缺乏真核细胞特有的加工后处理，而且在但缺乏真核细胞特有的加工后处理，而且在菌体中表达的外源蛋白，在原核细胞中不稳菌体中表达的外源蛋白，在原核细胞中不稳定，易

58、被菌体蛋白酶破坏。定，易被菌体蛋白酶破坏。酵母表达系统酵母表达系统v酵母表达系统是一个重要的真核表达系统，酵母表达系统是一个重要的真核表达系统，既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成对蛋白质转录后的修饰，也能进行诱导性分对蛋白质转录后的修饰，也能进行诱导性分泌泌; ;v但它具有活化的蛋白水解酶类，可降解异体但它具有活化的蛋白水解酶类，可降解异体蛋白质，使产品产量降低。蛋白质，使产品产量降低。昆虫表达系统昆虫表达系统v昆虫表达系统的优点是能较高水平地表达不昆虫表达系统的优点是能较高水

59、平地表达不同动物来源的基因，可以胞内表达，也可以同动物来源的基因，可以胞内表达，也可以进行分泌性表达，能够有效地进行蛋白质的进行分泌性表达，能够有效地进行蛋白质的翻译后加工。翻译后加工。v其主要缺点是不能连续合成重组蛋白，因为其主要缺点是不能连续合成重组蛋白，因为重组病毒感染昆虫细胞或昆虫幼虫重组病毒感染昆虫细胞或昆虫幼虫4-54-5天后，天后，细胞就裂解，幼虫即死亡。细胞就裂解，幼虫即死亡。哺乳动物细胞v哺乳动物细胞是生产哺乳动物蛋白质最好的哺乳动物细胞是生产哺乳动物蛋白质最好的场所，其表达真核基因比以前几种表达系统场所，其表达真核基因比以前几种表达系统更优越，能对蛋白质进行各种类型的加工和更优越，能对蛋白质进行各种类型的加工和修饰，还能表达有功能的膜蛋白及分泌性蛋修饰，还能表达有功能的膜蛋白及分泌性蛋白。白。v其缺点是组织细胞培养的技术要求高，培养其缺点是组织细胞培养的技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长，成本较高。因此，和筛选细胞株的周期长，成本较高。因此，选择和建立物美、价廉的表达体系，是蛋白选择和建立物美、价廉的表达体系，是蛋白质工程急需解决的问题。质工程急需解决的问题。