《结核分枝杆菌furA基因片段的克隆、表达和分离纯化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《结核分枝杆菌furA基因片段的克隆、表达和分离纯化（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1结核分枝杆菌 furA 基因片段的克隆、表达和分离纯化作者：高雪，薛莹，姜泓，柏银兰，师长宏，张海，李元，徐志凯 【关键词】 分枝杆菌 【Abstract】 AIM: To obtain furA (ferric uptake regulator A) gene segments of Mycobacteria tuberculosis (MTB), express efficiently in E.coli and purify the target proteins. METHODS: furA gene segments were amplified by PCR with speci
2、fic primers from genome of MTB H37Rv strain. After sequenced, furA gene segments were inserted into pRSETA and expressed in E.coli BL21. The recombinant (His)6 fused proteins were purified by NiNTA purification system. RESULTS: The length of PCR product was 453 bp, identical with that reported by Ge
3、nbank. The proteins were expressed in E.coli BL21 as soluble proteins, accounting for 10 of the total bacterial proteins. SDSPAGE and Western blot showed that the Mr of this gene product was 23.0103. The (His)6 fused proteins were purified by affinity chromatography. CONCLUSION: furA of MTB was succ
4、essfully cloned and 2expressed in E.coli BL21. The purified proteins are obtained by NiNTA purification system. This work lays the foundation for further study on the ferric uptake of Fe2+ in MTB. 【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis; FurA; cloning; expression; purification 【摘要】 目的： 获得结核分枝杆菌 furA 基
5、因片段并高效表达、纯化. 方法： 用 PCR 技术从 MTB 毒株 H37RvDNA 中扩增出相应大小的 DNA 片段，将片段与 pGEMTeasy 载体连接后测序. 将测序正确的 furA 按照 BamH和 Hind 酶切位点克隆入原核表达载体 pRSETA，将连接产物转化入 E.coli BL21，挑出阳性克隆，IPTG 诱导表达重组的(His)6 融合蛋白. 对重组融合蛋白通过镍柱进行纯化. 结果： PCR 获得的 furA 序列与 Genbank 报道的一致( 为453 bp). 重组载体在 E.coli BL21 中以可溶形式高效表达，融合蛋白经 SDSPAGE 和 Western
6、blot 分析，在 Mr 为 23.0103 处有特异的蛋白条带，目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的 10%，重组蛋白经镍柱进行纯化后，得到了高纯度的 FurA 融合蛋白. 结论： 成功克隆结核分枝杆菌 furA 基因片段，并在 E.coli BL21 中高效表达，亲和层析纯化后获得高纯度 FurA 融合蛋白. 【关键词】 分枝杆菌，结核；FurA；克隆；表达；纯化 0 引言 铁是维持结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)新陈代谢所必需的营养物质之一，研究认为通过调节代谢途径3来调控基因表达从而抑制 MTB 生长可以达到治疗结核病的目的1. 研究铁相关基因在
7、 MTB 代谢过程中的作用，有助于我们深入了解 MTB 的致病机制，从而有效地控制结核病的流行. MTB 中包括四种铁依赖的调节基因，它们编码的蛋白分属两个家族，分别为Fur 和 DtxR. 其中 Fur 家族又包括 FurA 和 FurB2,3 . 目前对于DtxR 家族蛋白的结构和功能研究得比较清楚，而对 Fur 蛋白的研究比较少. 我们从 MTB 中克隆 furA 基因片段，并在原核细胞中表达并纯化，为进一步探索其在 MTB 中的作用奠定基础. 1 材料和方法 1.1 材料 E.coli BL21, E.coli DH5, MTB H37Rv 菌株表达载体及pRSETA 由本室保存.寡聚
8、核苷酸引物由上海博亚生物技术有限公司合成；克隆质粒 pGEMTeasy 载体、质粒提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒、各种限制性内切酶、连接酶及 Taq DNA 聚合酶均为美国Promega 公司产品； IPTG 为 Sigma 公司的产品；(His)6 mAb 购自第四军医大学免疫学教研室，HRP 山羊抗小鼠 IgG 抗体购自华美生物公司；Ni2+NTA 纯化试剂盒购自 Invitrogen 公司；其余一般化学试剂均为国产分析纯.1.2 方法 1.2.1furA 片段的扩增参考文献4方法获得 MTB H37Rv的 DNA，以此为模板，设计一对引物 P1: 5GGATCCTCTAGTGTGTGT
9、CCTCTATACCG3,含 BamH酶切位4点；P2: 5AAGCTTGTAATGGGTGGGTGTTGC3,含 Hind酶切位点. PCR 反应条件： 94 40 s, 56 30 s, 72 1 min，共 30 个循环，72延伸 10 min. 1.2.2 目的基因的测序与克隆回收 PCR 产物，用 T4 连接酶将PCR 产物与 pGEMTeasy 载体连接，转化 E.coli DH5，经氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，将提取的质粒用 BamH和 Hind 双酶切，行琼脂糖凝胶电泳，有目的片段的则为阳性克隆，将筛选的阳性克隆由上海博亚公司完成测序，命名为 pGEMfurA. 1.2.3
10、目的蛋白的诱导表达和纯化将 pGEMfurA 被 BamH和 Hind双酶切的片段与原核表达载体 pRSETA 连接，命名为pRSETAfurA. 将 pRSETAfurA 转化入 E.coli BL21 中. 转化的细菌在含氨苄青霉素（50 mg/L）和氯霉素（35 mg/L）的 LB 培养基中过夜培养，按 150 的接种量进行转接，37摇菌 3 h 至 A=1，加入异丙基 D 硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为 1.2 mmol/L, 37继续通气培养 45 h.取 5 mL 菌液，收集菌体，菌体加入H2O 80 L，剧烈振荡混匀，再加入 2样品缓冲液 80 L, 100水浴 5 min，
11、离心 10 min；125 g/L 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，预计 Mr 为 23.0103 处有明显表达条带. 大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集菌体，超声裂菌，离心后将上清和沉淀分别制样，进行可溶性分析. 如果目的蛋白为可溶性的直接用镍离子柱进行亲和层析纯化. 1.2.4 亲和色谱法纯化目的蛋白采用 Invitrogen 的5Ni2+NTA 纯化试剂盒纯化目的蛋白. 将 50 mL 的诱导菌液离心，制备上柱样品，按照可溶性条件(native condition)进行亲和色谱纯化，收集洗脱液，4 保存. 1.2.5 纯化蛋白的 Westernblot 鉴定将上述表达产物进行125 g/L
12、SDSPAGE 后转移至硝酸纤维素膜上，50 g/L 脱脂奶在37封闭 1 h，加入 15000 稀释的(His)6 mAb，37 摇床孵育 1 h， PBS 洗涤 3 遍后，加入 HRP 山羊抗小鼠 IgG 抗体，37摇床孵育 1 h，PBS 洗涤 3 遍，加入底物液 DAB 显色4 . 2 结果 2.1furA 片段的扩增及序列测定用 PCR 方法以 MTB H37Rv为模板进行扩增，得到 453 bp 的目的片段（ Fig 1）. 挑取含插入片段的阳性克隆 pGEMfurA 测序，测序结果表明所扩增的 furA 与Genbank 公布的序列完全相同. 2.2 表达载体的构建 pGEMfu
13、rA 经 BamH和 Hind 双酶切后的目的片段与 pRSETA 进行连接反应后，转化入感受态细胞E.coli BL21，经氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆进行酶切鉴定，切出 453 bp 片段的为阳性克隆子（Fig 2） ，命名为 pRSETAfurA 1,2,3. 2.3 融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化将 pRSETAfurA1 转化入E.coli BL21, SDSPSGE 电泳显示有目的蛋白表达.进行可溶性分析发现融合蛋白有约 80位于菌体蛋白的可溶性上清中（ Fig 3）.上清直接经过镍离子柱进行亲和层析纯化，得到 Mr 约为 23.0103 的6目的蛋白（Fig 4）. 2.4 纯
14、化蛋白的 Westernblot 鉴定纯化后的 HisFurA 融和蛋白以鼠抗(His)6 mAb 为一抗，山羊抗小鼠抗体为二抗进行蛋白印迹分析，纯化蛋白在 Mr 为 23.0103 处有明显的免疫杂交带（Fig 5）. 3 讨论 铁作为营养物质对于大多数细菌都是必须的，但是摄入过多的铁会形成羟基引起细胞毒作用，所以细菌内有复杂的调控机制来控制铁的浓度. 在大多数细菌中，这项功能主要由 Fur 执行. Fur 可以调控一系列的生理反应包括调节铁的摄入量和调控毒力基因的表达4-6 . 在调节铁摄入的过程中，Fur 作为阻遏蛋白可以与二价铁形成稳定的复合物,该复合物与铁调控基因上游长度 19 bp
15、 的操纵子序列结合，从而达到抑制转录减低细胞内铁浓度的目的. 在环境中缺铁的情况下，Fur 蛋白不能与这些序列结合，相应的基因序列则去阻遏铁的摄取增加7. 目前关于 Fur 蛋白的研究主要局限于大肠杆菌，而 MTB 中 Fur 蛋白研究得较少. MTB 有两个调节铁摄入的直向同源基因，分别为 furA 和 furB. 它们在基因序列和蛋白结构上与大肠杆菌中的 Fur 蛋白有很高的同源性，所以推断它们与大肠杆菌 Fur 蛋白有相似的功能，在 MTB 的铁代谢中起了非常重要的作用，但是目前这个功能还没有被证实. FurA 蛋白有两个结构域：DNA 结合区和铁结合区. 根据它的结构分析它的功能除了在
16、细菌铁代谢中其重要作用外，还可能作为调节因子调控下游基因的表达. 7在分枝杆菌所有种属中，furA 都是直接位于 katG 基因的上游，而katG 基因可以编码过氧化氢酶过氧化物酶，它是 MTB 的主要毒力因子. 转录物作用图表明 katG 是由一个强启动子调控的,但是它自身并没有这个强启动子，目前认为其上游的 furA 可能作为 katG 基因的启动子，并调控 katG 基因的表达8,9 . 我们通过设计 MTB furA 特异性引物，采用 PCR 方法从MTB H37Rv DNA 库中扩增出目的片段 furA，序列测定与Genbank 完全一致. 为使融合基因得到高效及稳定的表达以及考虑到将来的纯化工作，我们构建了(His)6 融合表达载体pRSETAfurA，在大肠杆菌 BL21 中获得了高效表达. pRSETA 表达载体为 2900 bp，核糖体结合位点下游接有 6 个组氨酸，其后
