《CLIACAP二代测序临床检测标准操作指南.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CLIACAP二代测序临床检测标准操作指南.docx（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、CLIA/CAP 二代测序临床检测标准操作指南2015-04-23自由度精准医疗本临床二代测序操作指南来自于Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) of 1988/College of American Pathologists (CAP) laboratory。释义：Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) of 1988：美国临床实验室改进修正法规88 。这个法规里面有关于医学检验项目的一些质量规范，中国的临床行业很多项目的指标都参考过 CLIA88 中的内容。Colleg
2、e of American Pathologists (CAP) laboratory：美国病理学家协会。相较于Sanger测序，二代测序技术（新一代测序技术，NGS）拥有高通量和低单碱基成本的特点，这使其在临床检测领域拥有得天独厚的优势。过去的数年间，相当数量的NGS服务商迅速成长，而美国病理学家协会却没有及时依照美国临床实验室改进修正法规（CLIA）编制指南来规范这个检测。基于NGS平台的临床检测是一种新的检测方式，相较于原有检测方法，其复杂程度大大提高，因此迫切需要一个规范标准来指导各实验室进行检测。CAP于2011年成立了NGS工作部门，商讨NGS临床检测实验检查表的内容。本次CAP列
3、出共计18条实验室要求的检查表，包含检测的二代测序实验过程和生物信息学分析过程。二代测序技术（NGS）包含两个部分：实验操作部分（wet bench）和生物信息分析部分（dry bench）。实验操作部分包括以下部分或所有的流程：病例样本的采集处理、核酸提取、片段化、生物分子标签（barcode）、目标区段/基因捕获富集、连接、扩增、文库构建、上机测序、数据产出。生物信息分析部分主要依赖于高性能的计算机和不同的生物信息分析方法，主要流程包括：参考序列比对、组装、变异检测、注释、临床解释（依赖于是否运用诊断工具）。CAP依据NGS实验操作部分和生物信息分析部分分别建立了独立执行标准和检测事项：实
4、验操作部分检测条目包括标准操作流程文件的建立、流程验证、质量管理体系、数据可靠性验证、异常情况记录及维护更新；生物信息分析部分检测条目包括：变异结果描述、附带结果的报道、数据储存、版本可追溯性及数据传输安全性。实验操作部分实验操作标准操作流程文件NGS实验室需要建立一个标准操作流程文件用来指导产生NGS实验数据对于临床实验室来说，一个详细的NGS实验标准操作流程文件是实验室质量评估的一个重要指标。标准操作流程文件中需要包括DNA/RNA样本准备、片段化、建库、样本分子标签（barcode）、样品混合、上机测序相关的所有标准操作流程指导。在此基础上，所有独立的实验步骤和后续的操作才能够一一被追溯
5、。标准操作流程文件需要包括NGS实验过程中所有相关的方法、试剂、仪器、软件、软件版本等，此外，还应对质控标准进行详细描述，包括详细的质控参数、接受域和否定域。例如目标区段捕获测序实验，需要描述捕获区段的基因组信息（包括目标区域基因组位置、所包括的基因等）、捕获富集的具体方法及流程、包含不同类型临床样本（血液、FFPE）处理方法的SOP等。NGS实验操作流程验证实验室必须对实验操作流程进行验证，并且当流程有修订的时候，必须要对整个实验操作过程进行重新确认，以检验修订后的流程是否能够符合要求。重新验证的程度和范围视修订的程度和范围而定。所有实验室自己研发的分子诊断或临床检测项目，在进行临床应用前必
6、须对NGS每个操作流程的性能表现进行一个内部的验证。NGS实验是一个复杂的工作流程，它由很多独立步骤组合而成。每步流程都需要分别优化到一个最佳经验值，以此来综合决定最佳的实验操作条件及各参数的设置。在内部验证中需要考虑的必要因素包括：实验的敏感性和特异性、准确性、精确性以及检测能力的上限和下限（动态范围）。对于任何一个分子实验，对于不同的样本类型（血液、唾液、组织等）都需要独立的进行一个验证。考虑到NGS技术并不能够完全的检测到所有理论上的变异情况，因此我们需要结合“其它检测方法（Sanger、芯片）”和“特定分析物（positive controls）”的手段来验证NGS实验的检验性能。必须
7、要考虑的一些性能参数：1、分析灵敏度：可参考一个金标准的方法来观测NGS技术能检测出的最多的变异位点的数目。需要注意的是，在验证分析灵敏度“基准线”的时候，要尽可能的考虑全基因组上不同的区域。此外，也需要对基因组上不同的变异类型分别进行独立的检测（SNP、CNV、SV、homopolymers）。验证过程中，阳参也是必需的。可以选择一些包括相关变异（例如p.F508del in CFTR）的病例样本作为阳参进行验证。2、注意一个统计方法所涉及的假阳性和假阴性问题。考虑到不同方法对特殊样本（肿瘤样本，ctDNA，嵌合体）检测局限性，有时sanger测序并不是所有变异检测的金标准。所以在这种情况下
8、，可通过稀释样本混合实验（dilution of samples with known allele frequencies）来测试NGS技术检验变异能力的动态范围。另外，数据的精确性可通过生物学重复（至少三个样本）和技术重复（相同样本不同barcode）来评估。3、注意同源序列的干扰，如果实验对象有这样的情况存在，需提前进行同源序列比对分析。实验室必须提供一个方法来确认检测出的变异已排除了假基因同源序列的干扰，并且呈现此方法准确合理的证明文件。4、如果样本通过标签（barcode）进行混样，必须证明每个样本在实验操作过程中保持样本各自的特异性。NGS实验操作流程质量管理体系实验室必须遵循质量
9、管理体系来进行NGS实验操作CAP认证的实验室必须建立一个质量管理体系，实验室规模、临床市场、专业知识以及实验室主管在质量保证程序中的决策权共同决定了质量管理体系的内容。质量管理体系必须是文字记录的，且与设计文件内容相符一致。对于一个进行NGS实验的实验室来说，一个高质量的质量管理体系应包含以下属性：1、 质量管理体系有明确的技术路线（工作流程），包括有评估实验前期的操作步骤、测序过程、实验后期分析工作的报告。2、NGS质量管理体系需要纳入到所在机构总的质量体系中。如果实验室只是医院或医疗中心的一部分，其NGS质量管理体系必须适从整个机构的质量保证程序内容。3、管理体系中应当标注在实验过程中存
10、在的常见问题。标明这些问题对结果的影响或对临床应用的影响以及是否违背实验室的一些政策和相关程序。体系文件中需要包含每次矫正的记录、效果以及操作准则和流程的修订内容。4、质量管理体系的宗旨是保证所进行的检测是临床目的相关的。尤其对于NGS，在没有其它检测能力相当的检验方法存在的情况下，这个宗旨尤为重要。检验分析的合理适当性必须以医学科学为基准。5、管理体系应当鼓励实验人员对整个检测程序内容提出意见与建议，员工的意见与建议调查必须包括在质量保证系统里。NGS结果验证实验室需要一个相关政策方案用来进行NGS检测变异结果的验证考虑NGS技术的不断发展，人们也意识到基于NGS实验所涉及的假阳性和假阴性的
11、问题。CAP根据不同实验室的性能评价灵活的决定该实验室什么时候进行结果验证实验、实验怎样进行以及是否推荐利用NGS以外的技术在其它家系成员中进行结果验证。每个进行NGS实验的实验室必须有个政策，明确指示验证实验需要进行，或者有个证明文件说明相关的验证为何不需要。CAP给予实验室足够的灵活性去选择适当的结果验证的方法（并不完全依赖于Sanger，可以是碱基特异性的聚合酶链反应，溶解曲线分析）。实验记录在实验过程记录中，处理样本的方法、仪器、试剂必须是可识别且可追溯的在临床NGS实验过程中，一个全面完整的实验记录是必需的，包括整个实验过程中的实验条件、步骤、计算软件等。相应的，完整的存档记录必须明
12、确表明整个实验过程中每个临床样本的试剂、引物、测序化学反应、平台都是可追踪的。此外，记录中还应包括对检测的目标区段的描述（基因组、外显子、特定基因、特定panel、转录本或甲基化区段），分析中引用的细节（文献，网站）。建议实验室最好建立一个文档记录系统，详细的记录上述细节，并可随时调档查阅。特殊案例记录实验室需要建立一个特殊案例记录文档，用来记录偏离NGS标准实验操作流程的特殊病例样本情况当检测对象及操作过程偏离实验SOP时，实验室需要对此案例进行记录，并做详细的解释说明。偏离的情况比如收到一例非常规样本后改变实验操作流程、文库构建及上机测序步骤。当接受一个样本时，就需要对样本是否满足实验要求
13、作出判断。如果存在犹豫及疑问，需要在工作记录中标注出，并及时与导师或实验室主任进行交流讨论。同时，需要与样本收集人沟通此问题，并将交流讨论的内容记录在工作文档中或做电子文档记录。特殊案例记录需要包括跟问题样本相关的所有方面，包括发现的问题、解决方案、相关的交流（涉及的人员，通知人与被通知人，时间）。相关记录必须列入每月质量控制报告中。有时，实验室的SOP也需要进行更改，促使实验操作步骤更加细致明确，并剔除一些偏差误差。这种情况下，所提议的修改的内容需要实验室导师或其它与实验技术直接相关的技术人员在内的2位以上成员同意，并且修改的内容必须是经过实验室主任签字认可的。更新维护实验室必须具有相关政策
14、用来对NGS实验过程中相关仪器、化学溶剂、试剂的升级更新进行监测、更新实施和记录为防止实验使用过时的、被淘汰的方法，实验室需要及时升级更新。因此，NGS实验室必须出具相关政策方案，用来定期检测和更新在实验过程中的仪器、化学溶剂、试剂。NGS实验中所用到的最新的文库构建、扩增、测序的方法是被实验室所验证过的，能够有效的提升数据质量的重复性和实验的准确性的。此外，方案中还需注明检测升级更新的方法，更新的实施时间（每次更新的间隔时间）以及在临床实际应用前的进一步验证方案。生物信息分析部分NGS数据相关生物信息分析可分成三个主要步骤：首先是产生记录碱基序列信息、碱基质量的FASTQ格式文件。FASTQ
15、文件中，每4行显示一条read信息，包括碱基类型、标识符及碱基质量信息，FASTQ类型文件也是目前NGS领域中应用最广泛的信息储存类型；第二步是将检测获得的序列与参考基因组进行序列比对，以此检测病人序列与参考基因组序列之间的差异，之后将这些差异与基因、蛋白功能关联，进行注释；最后一步是将检测出的变异与病例表型信息相关联，筛选结果（标注与疾病相关的稀有变异；基于家系做筛选）并形成临床报告。结合NGS的临床诊断需要依赖于各种生物信息计算方法及软件，临床实验室在针对不同诊断应用时需要能够合理有效的选择相应的数据计算方法及生物信息分析软件。同时，对于这些算法和软件，实验室需要利用大量的样本来验证所用算
16、法、软件在分析不同变异类型时的灵敏度、特异度以及重复性，以此来确认所用的生物信息学分析工具及参数是否符合标准，符合实验室要求及临床报告标准。一旦方法工具确认后，实验室也需要对运用于临床诊断的生物信息分析各步骤进行记录描述，并对这些步骤实施一个质量管理方案。NGS生物信息分析标准操作流程文件实验室需要准备一份标准操作流程文件用来规范NGS生物信息分析中的数据分析、描述、及结果报告流程。实验室必须详细记录描述分析过程、结果报告中涉及到的所有算法、软件、数据库信息。分析流程中的这些软件、算法、数据库的版本必须是可查询且可追溯的。实验室必须明确详细的记录与默认参数不一致的自定义参数设置。在序列比对中，所用到的参考基因组序列版本号及组装的细节也需要详细记录在文件中。SOP文件中需要详细的描述NGS数据的整
