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1、1经纹状体注射胶质细胞系源性神经营养因子对帕金森病模型小鼠黑质多巴胺能神经元保护作用的实验研究 作者：王炎强，刘洪梅，王红军，曹俊平，肖成华，高殿帅 【关键词】 多巴胺能神经元 摘要 :目的 研究经纹状体注射胶质细胞系源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GD-NF ）对帕金森病（Parkinson disease，PD）模型小鼠中脑黑质多巴胺能神经元的保护作用。 方法 利用 1-甲基-4-苯基 1，2，3 ，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3 ，6-tetrahydropyridine，MPTP）制
2、备成年小鼠 PD 模型，通过单侧纹状体定位注射 GDNF，取中脑黑质节段，做连续冠状石蜡切片，结合免疫组织化学染色方法，观察各组酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH ） 、钙结合蛋白（calbindin D28k，CB）的表达，光镜观察并细胞计数，统计学分析。 结果 在模型制备的第 4、6天，单侧纹状体定位注射 GDNF 后，小鼠黑质致密部 TH 与 CB 阳性神经元数量显著多于注射 PBS 组。 结论 经纹状体注射 GDNF对成年 PD 小鼠黑质多巴胺能神经元具有保护作用，且这种保护作用可能与细胞内 CB 表达增加有关。 2关键词 :胶质细胞系源性神经营养因子;多巴胺
3、能神经元;1-甲基 4-苯基-1，2 ，3， 6-四氢吡啶 Abstract:Objective To investigate the protective effect of intrastriatal GDNF on dopaminergic（DA）neurons in the sub-stantia nigra of MPTP-induced mouse model of Parkinson disease（PD）.Methods The PD model was established in adult KM mice four or six days after an intrape
4、ritoneal injection of MPTP30mg.kg.The model mice were then treated by giving GD-NF into the striatum.After a seven-day survival period，the model mice were sacrificed to get the segment of substantial nigra（SN）fixed，embedded and coronally sectioned continuously.The microsections were processed by imm
5、unohistochemistry using anti-TH and anti-CB antibodies to label DA neurons and CB-containing neurons respectively，which were counted under microscope and analyzed statistically.Results Seven days after the steriotaxic intrastriatal injection of GDNF，the numbers of TH and CB positive neurons were fou
6、nd significantly higher than that in the untreated model mouse control group.Conclusion Intrastriatal GDNF can protect DA neurons in PD model mice，and this role may be related to the increase of CB 3expression. Key words:glial cell line-derived neurotrophic factor;dopaminergic neurons;1-methyl-4-phe
7、nyl-1，2，3，6-tet-rahydropyridine 帕金森病（PD）是一种中枢神经系统退行性疾病，主要病理变化是中脑黑质多巴胺能神经元进行性变性死亡，导致其靶区尾状核与壳核内的多巴胺含量降低1-2 。胶质细胞系源性神经营养因子（GD-NF ）是多巴胺（ DA）能神经元的神经营养因子之一，自从 1993 年由 Lin 等人从大鼠 B49 胶质细胞系中分离纯化后，大量的实验证实其对腹侧中脑 DA 能神经元有特异性的促存活和促形态学分化作用37 。由于 GDNF 是神经肽类大分子物质，不能通过血脑屏障，所以在应用 GDNF 治疗 PD 的过程中，主要问题在于如何让其越过血脑屏障而进入中枢
8、神经系统。我们实验室已证明了向 PD 模型大鼠的黑质部位注射 GDNF，能明显改善 PD 症状，促进 DA 能神经元的存活。但是黑质位置较深、范围局限，直接向黑质注射 GDNF，损伤相对较大、难度相对较高。于是设想如果向DA 能神经元的靶区纹状体注射 GDNF，是否会通过逆行运输而保护黑质致密部的 DA 神经元呢?我们通过利用 1-甲基-4-苯基-1，2 ，3 ， 6-四氢吡啶（MPTP）构建的 PD 模型小鼠，经纹状体注射外源性 GDNF，观察黑质致密部 TH 和 CB 阳性神经元的数量变4化情况，评价经此途径给予 GDNF 对黑质 DA 能神经元的保护作用。1 材料和方法 1.1 材料 1
9、.1.1 试剂和主要仪器 胶质细胞系源性神经营养因子（ glial cellline-derived neurotrophic factor，GD-NF） ，MPTP ，小鼠抗大鼠酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH ）抗体（一抗） ，Sigma 公司 ;生物素结合的羊抗小鼠单克隆抗体（二抗） ，Sigma 公司; 封闭用羊血清原液，北京中杉生物工程有限公司;辣根过氧化物酶标记的生物素卵白素复合物，Sigma 公司;其他试剂均为国产分析纯或化学纯。YL3A 型回转式石蜡切片机，上海仪表厂;病理组织漂烘处理仪，江苏常州中德电子仪器厂;Olympus 光学显微镜，日本;Ol
10、ympus PM-CB20 显微照相系统，日本 ;LEICAQWin 图像处理与分析系统，德国。 1.1.2 实验动物 昆明小鼠，雄性，78 周龄，体重2025g，小鼠每笼 8 只饲养，自由进食、饮水。由徐州医学院实验动物中心提供。 1.2 方法 51.2.1 昆明小鼠 PD 模型的建立 实验组 24 只，对照组 6 只。实验组腹腔注射 MPTP30mg.kg，对照组注射同等剂量的生理盐水，每天上午 8 时，连续给药 5 天。同时实验组 24 只动物又随机分为4 组，每组 6 只:GDNF4 天组;在制备 PD 模型的第 4 天右侧纹状体立体定位注射 GDNF;PBS4 天组;在制备 PD 模
11、型的第 4 天右侧纹状体立体定位注射 PBS;GDNF6 天组;在制备 PD 模型的第 6 天右侧纹状体立体定位注射 GDNF;PBS6 天组;在制备 PD 模型的第6 天右侧纹状体立体定位注射 PBS。 小鼠腹腔内注射 10%水合氯醛进行麻醉，按照 Paxinos and Watson（1997 ）图谱选择坐标。坐标为（mm）:P（前囟前） ，+0.9;L（旁开） ，-2.0;V（硬膜下） ，+3.5。用 10l 的 Hamiton 微量注射器抽取液体，注射速度为 0.5l.min，注毕留针 5min，并以1mm.min 的速度缓慢退出。GDNF 溶液以无菌的 0.01mol.L PBS配制
12、，其浓度为 20g.L，共 1l，另 2 组注射相同体积的无菌0.01mol.L PBS。 1.2.2 取材切片 将制备模型后第 7 天实验各组的 6 只 KM 小鼠腹腔内注射 10%水合氯醛进行麻醉，经左心插管生理盐水、多聚甲醛灌注固定后取中脑部分后固定。梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。做黑质节段连续冠状切片，片厚 6m，切片分组收集。切好的脑片贴于事先用多聚赖氨酸处理好的玻片上，37烘烤过夜，6备用。 1.2.3 免疫组织化学染色 切片脱蜡至水，3% 过氧化氢去除内源性过氧化物酶，微波修复，0.5%正常羊血清封闭，37，30min。依次加入小鼠抗 TH 抗体（13000）或小鼠抗 C
13、aBP 抗体（11000） ，生物素结合的羊抗小鼠 Ig（150 ） ，辣根过氧化物酶（HRP ）标记的生物素卵白素复合物。以上各步骤之间均用0.01mol.L PBS 冲洗 3 次，每次 5min。最后用 DAB 分别对 CB 和TH 进行显色反应。对 DAB 显色的切片用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 1.2.4 计算机辅助图像分析系统进行图像分析 用计算机辅助图像分析系统，在目镜10 物镜20 的倍数下分别对各时相点的TH + 细胞和 CB + 细胞进行定量分析。将小鼠每个中脑组织切片从嘴侧至尾侧分为前、中、后 3 个区域。任意选择带有明显核仁的有清晰轮廓的 TH + 神经元或
14、 CB + 神经元作为测量对象，测定单位面积内阳性细胞数。 1.3 统计学处理 使用单因素方差分析程序，分别对均数两两间进行比较和显著性检验，P0.05 有显著性差异。 2 结果 72.1 TH 免疫组织化学染色结果 TH 是多巴胺合成的关键酶，也是多巴胺能神经元的标志酶。本实验以此为指标评价经纹状体注射 GDNF 对多巴胺能神经元的保护性作用。腹腔注射 MPTP12 天后，中脑黑质 TH 阳性神经元数目明显减少，腹腔注射 MPTP 实验组（33.6678.383） （n=6 ） ，而腹腔注射生理盐水对照组（60.33310.708） ，两组相比结果显示有统计学意义（P0.01） 。GDNF4
15、 天组， GDNF6 天组，分别与 PBS4 天和 PBS6 天组比较，结果显示中脑黑质 TH 阳性神经元数目不同程度的增加，PBS4 天与PBS6 天组相比没有统计学意义，以后统称为 PBS 组，细胞计数结果为:GDNF4 天组（54.3336.919） （n=6） ，GDNF6 天组（75.6675.391） （n=6） ，PBS （21.1674.997） （n=6） ，有统计学意义（P0.01 ） （图 1，2） 。同时 GDNF4 天组与 GDNF6 天组相比较也有明显的统计学意义（P0.01） 。总之通过以上的比较，在 MPTP 损伤早期，在 GDNF 生理剂量早期变化的不同阶段，
16、经纹状体注射 GDNF 可能对损伤灶周围受累的 DA 神经元的生存、结构及功能的恢复起一定的作用。 图 1 各组小鼠黑质内 TH 阳性细胞数的比较（略） （制备 PD 小鼠模型的第 4 天和第 6 天，纹状体内给予GDNF，存活 7 天时单因素方差分析， *P0.01） 8图 2 各组小鼠在腹腔给予 MPTP 的不同时间点，同侧黑质TH 免疫组织化学染色（DAB 法，bar=10m） （略） A.小鼠在腹腔给予 MPTP 的第 4 和第 6 天，单侧纹状体内给予 PBS 后第 7 天同侧黑质 TH 免疫组织化学染色 B.小鼠在腹腔给予MPTP 的第 4 天，单侧纹状体内给予 GDNF 后第 7 天同侧黑质 TH免疫组织化学染色 C.小鼠在腹腔给予 MPTP 的第 6 天，单侧纹状体内给予 GDNF 后第 7 天同侧黑质 TH 免疫组织化学染色 2.2 CB 免疫组织化学染色结果 腹腔注射 MPTP12 天后，中脑黑质 CB 阳性
