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1、1清开灵对兔实验性葡萄膜炎治疗机制研究作者：刘静霞 张晓冬 吕瑞民 聂浩劫 陈德欣 张魁魁 【摘要 】 目的 观察清开灵注射液对葡萄膜炎的防治作用与机制。方法 40 只实验兔随机均衡分为正常组、模型对照组、激素治疗组、清开灵治疗组，分 5 个不同时段检测兔眼炎症积分及房水和外周血中 IL-2、TNF- 含量。结果 造模后不同时段各组兔眼部炎症积分逐渐增加，房水和外周血中 IL-2、TNF- 逐渐升高，与正常组比较差异有统计学意义（P0.001） ；清开灵治疗组不同时段各项指标均明显低于模型组（P0.01） ，与激素治疗组疗效相似（P0.05） 。结论 清开灵注射液具有控制并改善兔实验性葡萄膜炎
2、临床体征，抑制房水和外周血中 IL-2、 TNF- 的作用，在一定程度上与激素疗效相近，可作为葡萄膜炎的治疗用药。 【关键词】 清开灵注射液 实验性葡萄膜炎 细胞因子 体征 葡萄膜炎是一类十分常见的致盲眼病，在我国致盲眼病中约占第37 位12，长期以来，西医治疗本病多以糖皮质激素或免疫抑制剂为主，因其相应的毒副作用而使临床应用受到局限，故开发中药治疗葡萄膜炎前景看好。清开灵注射液是近年来常用于治疗热性疾病的一种新型中药制剂，其主要药物成份具有显著抗炎作用，且无激素类副作用，但尚缺乏对其治疗葡萄膜炎作用的实验研究。本课题旨在通过动物实验研究，探讨葡萄膜炎的发病机理和清开灵治2疗葡萄膜炎的疗效与作
3、用机制，现报告如下。 1.实验材料 1.1 动物 健康成年新西兰大白兔 40 只，雌雄各半，无眼疾，体重 2.22.5kg，常规分笼饲养（黑龙江中医药大学动物实验中心提供） 。 1.2 药物 清开灵注射液（广州明兴制药有限公司生产，规格10ml/支) 、地塞米松、9/L 生理盐水均为同一产家、同一批号药品。1.3 主要试剂与仪器 4% BSA（天象人生物工程有限公司)，IL-2、TNF- 放免药盒（北京普尔伟业生物科技有限公司)，均为同一批号；YZ-5B 裂隙灯显微镜、检眼镜（苏州医疗仪器厂)、MX 全自动荧光免疫分析仪（美国 ABBOTT 公司)，高速低温离心机（日本日立公司)、低温冰箱（日
4、本三洋公司) 等。 2.实验方法 2.1 造模方法 参照吴树扬等人方法 3用 BSA 作异体抗原，玻璃体及耳缘静脉二次注射法诱导实验性葡萄膜炎动物模型。 2.2 分组与给药方法 40 只兔随机均衡分成 4 组，每组 10 只，雌雄各半，体重相近。 (1）正常组：不造模。 (2）模型对照组：造模后第 2 天开始予同清开灵治疗组等体积的生理盐水耳静脉注射，每日 1 次，连续 2 周。 (3）激素治疗组：造模后第 2 天开始按每日 10mg 剂量予地塞米3松注射液耳静脉注射，每日 1 次，连续 2 周，根据实验动物与人体体表面积换算表4换算确定给药量。 (4）中药治疗组：造模后第 2 天开始按每日
5、30ml 予清开灵注射液耳静脉注射，每日 1 次，连续 2 周，剂量换算方法同激素组。 2.3 观察指标及检测方法 2.3.1 炎症积分评价 分别于造模后第 1、3、7、10、14 天用裂隙灯显微镜及检眼镜检查各兔眼部体征，按 04 级标准5 评价记录炎症积分。 2.3.2 房水及外周血细胞因子检测：各组造模前、造模后第1、3 、7 、 10、14 天分别抽取房水 0.5ml、耳缘静脉血 2ml(分离血清)，置 -20保存备用。采用放免法测定房水及外周血中细胞因子IL-2 和 TNF- 含量。 2.4 统计学方法 数据以均值标准差表示，采用 SPSS16.0 统计软件进行方差齐性检验和显著性检
6、验，各时段组间均数以及组内均数比较分别采用随机区组设计的单因素和两因素 ANOVA 方差分析检验后进行检验或近似检验、配对 t 检验，检验水准=0.05（双侧)，P 0.05 具有统计学意义。 3.结果 3.1 不同时段各组兔眼部炎症积分评价 造模后 114 天模型对照组炎症积分不断增高（P0.001) ，表明本实验中 BSA 诱导兔眼葡萄膜炎体征可持续加重 2 周以上。激素治疗组和清开灵治疗组兔眼炎症积分分别自第 7 天和第 10 天呈下4降趋势，至第 14 天最低，治疗前后比较均有统计学意义（P 0.001)；从第 7 天以后两治疗组兔眼炎症积分均明显低于模型对照组（P0.01)，但两治疗
7、组间差异无统计学意义（P0.05)。3.2 不同时段各组兔血清中细胞因子的变化 正常组兔外周血中 IL-2 具有一定表达，其前后时段差异及其与其它三组造模前比较均无统计学意义（P0.05)。造模后三组兔外周血 IL-2 自第 1 天开始逐渐升高，各时段水平均明显高于正常组（P 0.001)，且以模型对照组升高水平最为显著（P0.001) ；激素治疗组和清开灵治疗组于第 7 天即呈下降趋势，至第 14 天接近第 1 天水平，与造模前相比差异有统计学意义（P0.001)，但两治疗组间比较无统计学意义（P0.05) 。 TNF- 在正常组兔外周血中具有一定表达，其前后时段差异以及与其它三组造模前比较
8、均无统计学意义（P0.05)。造模后第 1天，三组兔外周血 TNF- 升高，但无统计学意义（P0.05)，自第 3 天后各时段水平均明显高于正常组（ P0.01)，且以模型对照组升高水平最为显著（P0.001)；激素治疗组和清开灵治疗组于第10 天呈下降趋势，至第 14 天明显低于模型组（P0.05)，与造模前相比差异有统计学意义（P0.001)，但两治疗组间比较无统计学意义（P0.05)。 3.3 不同时段各组兔房水中细胞因子的变化 IL-2 在正常对照组兔房水中具有一定表达，但其前后时段差异以5及与其它三组造模前比较均无统计学意义(P0.05)。造模后第 1天三组兔房水中 IL-2 略升高
9、但组间比较无统计学意义 (P0.05)，自第 3 天后各时段水平均明显高于正常组，且以模型对照组升高水平最为显著(P0.001)；与模型组相比，激素治疗组和清开灵治疗组从第 3 天即明显下降(P0.001) ，但两治疗组间比较无统计学意义(P0.05)，与造模前相比差异有统计学意义(P0.001) 。 TNF- 在正常组兔房水中具有一定表达，其前后时段差异以及与其他三组造模前比较均无统计学意义(P0.05)。造模后三组兔房水中 TNF- 逐渐升高，各时段水平均明显高于正常组(P0.001) ，且以模型对照组升高水平最为显著(P0.001)；与模型组相比，两治疗组自第 3 天开始明显下降 (P0
10、.001)，第 3、7 天两治疗组水平比较无统计学差异(P0.05)，第 10、14 天两治疗组水平比较有统计学意义，各自与造模前相比差异有统计学意义(P0.001)。 4.讨论 葡萄膜炎，尤其是内源性葡萄膜炎发病机制复杂，至今尚不完全清楚。近年来，随着分子生物学和免疫学的发展，人们日益认识到葡萄膜炎是一种器官特异性自身免疫病，体液免疫和细胞免疫均参与葡萄膜炎的发生。多种葡萄膜炎被认为是针对特定眼部蛋白的抗原特异性 T 细胞介导的自身免疫反应67。已有研究证实8多种细胞因子及炎性介质在本病的炎症和免疫反应过程中起着重要作用，TNF- 是一种炎性细胞因子，IL-2 作为一种免疫增强因子，它们与葡
11、萄膜炎的发病呈正相关，在葡萄膜炎活动期均显著增高。目前糖6皮质激素仍是西医治疗葡萄膜炎的主要有效药物，但临床中因其毒副作用而受限。糖皮质激素对细胞免疫和体液免疫均有影响，但总体而言，对细胞免疫的抑制作用大于对体液免疫的抑制作用。可以抑制细胞因子的合成和释放，也可通过影响激活转录因子而间接发挥对细胞因子的影响，如可抑制 IL-2 的产生、 IL-2 受体的表达、IL-2 和 TNF- 的基因转录9。 中医学认为葡萄膜炎是属多因病症，热毒湿瘀并存，内外因相关10。清开灵是由牛黄、水牛角、黄芩、金银花、栀子等组成的具有清热解毒化湿，祛痰通络开窍之功效的纯中药复方制剂，研究表明11该药能促进组织细胞代
12、谢，其显著的抗炎免疫作用类似于环孢霉素，并与之协同。通过静脉滴注迅速到达葡萄膜组织，从而控制炎症，遏止病势发展，且无激素和免疫抑制剂的毒副作用。本研究发现，BSA 诱导的实验性葡萄膜炎兔在不同观察时段主要呈现虹膜充血、纹理不清、后粘连、前房闪辉、渗出、积血或积脓等眼部炎症体征，同时其血清和房水中 IL-2 和 TNF- 亦显著升高，此结果与文献报道相似5。清开灵注射液治疗后眼部炎症积分及血清、房水中 IL-2 和 TNF- 不断降低，同激素治疗效果相近。提示清开灵注射液能够控制和改善葡萄膜炎临床体征，可能通过抑制某些炎性细胞因子和免疫调节因子的产生或表达，调节自身免疫功能，防止炎症介质的产生，
13、从而达到控制和治疗葡萄膜炎作用，在一定程度上与激素疗效相近，且无激素类药物的副作用，可作为葡萄膜炎的临床治疗用药，具有良好的眼科应用前景，鉴于本实验尚属小样7本量初步观察，其确切的治疗作用机制有待于不断深入研究探讨。 项目来源：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（No.10553011） 参 考 文 献 1杨培增，李绍珍，主编.葡萄膜炎M.北京：人民卫生出版社，1998：76 89. 2杨培增.葡萄膜炎的诊断及相关问题 J.中华眼科杂志，2002，(38):250253. 3吴树扬，肖继皋，王育良.牛血清蛋白诱导兔葡萄膜炎免疫病理形态学观察J.中华眼底病杂志， 1994，10(3):153155.
14、 4施新猷.医学动物实验学 M.北京：人民卫生出版社，1980：448. 5古继红，詹宇坚，关国华.消炎 I 号方对免实验性葡萄膜炎治疗作用的初步研究J.中医研究， 2000，13(3)：10 12. 6Whitcup SM, Nussenblatt R B. Immunologic mechanisms of uveitis J. Arch Ophthalmol, 1997;115:520 7Dick AD, Isaacs JD. Immunomodulation of autoimmune responses with monoclonal autibodies and immunoadhesins treatment of ocular inflammatory disease in the next millennium J J Ophthalmal, 1999;83:1230 8李志杰，彭少华.自身免疫葡萄膜炎的免疫学机制 J.中华眼底病杂志，2001，17 （ 3）：252254. 89杨培增主编.临床葡萄膜炎 M.北京：人民卫生出版社，2004，130133. 10詹宇坚，付志慧.葡萄膜炎的中医治疗研究近况J. 中国中医眼科杂志,1996,6(1):6163 11胡土星，李绍珍.葡萄膜炎的治疗（综述与译文）J. 国外医学眼科分册，1990， （14）：260.
