《液相色谱法纯化人血清C2蛋白》由会员分享，可在线阅读，更多相关《液相色谱法纯化人血清C2蛋白（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1液相色谱法纯化人血清 C2 蛋白作者：黄亚渝郭立安章必成胡军梁峰 【关键词】 色谱法 关键词: 色谱法，液相;补体 2;血清;纯化 摘 要: 目的 建立一种从血清中提纯 C2 的方法，得到稳定的、有活性的纯品，便于今后进一步研究其生理病理功能. 方法 利用冷球蛋白沉淀、优球蛋白沉淀、离子交换色谱、硫酸铵沉淀和亲和色谱几种方法，将血清中不同性质的杂蛋白除去，选择相对简单且分离效果好的条件，提高终产物中目标蛋白 C2 的纯度和含量. 结果 成功地从 1L 血浆中提纯到了 2.49mg C2，产率为 12.46%，活性回收率为 13.68%.终产物在 pH 中性时稳定，且无需加入蛋白稳定剂. 结论
2、 本法与以往纯化 C2 的方法相比，简便可行，产率及活性回收率较高，适用于实验室研究和大规模制备. Keywords:chromatography，liquid;complement2;serum;purification Abstract:AIM To establish a method for purification of 2C2from human serum，to obtain the stable and active purifica-tion and to study its physiological and pathological function easily in
3、the future.METHODS Using a combination of cryoglobulin precipitation，euglobulin precipitation，ion-ex-change chromatography， （NH4 ）2 SO4 precipitation and affinity chromatography，the impurity protein of different quality was removed，and the easy and effective condition was selected toincrease the pur
4、ity and content of C2in the final product.RESULTS 2.49mg final product was homogeneous by the criterion of SDS-PAGE representing the12.46%yield and13.68%activity recovery from1000mL serum.They were stable in pH neutral and no stabilizing agent was needed.CONCLUSION Compared with the past method，this
5、 method with high yield and activity can be used for laboratory research and large-scale preparation. 0 引言 补体系统是机体免疫防御机制的重要组成部分，它既是生理性的防御物质，又是造成病理性损伤的介质1 .补体的分离纯化为进一步研究其生理病理功能奠定了基础.C2 蛋白是补体经典激活途径中最早的限速因子.它在血中的浓度极低且极易水解，与浓度较3高的 B 因子相比性质十分相似，造成对 C2 进行分离提纯和检测分析的困难2 .Polley 等3 曾分离到极少量的 C2，但纯度不高，且需要人血清白蛋
6、白作为稳定剂.Mayer 等4 通过 C4 包被的致敏红细胞的吸附，得到了稳定的豚鼠 C2 样品，但不能应用到大规模制备上.我们采用液相色谱等方法成功地从人血清中分离到稳定的 C2 纯品. 1 材料和方法 1.1 材料 人血浆购自本校西京医院血库 .盐酸苯甲脒购自Fluka.Chemie AG 公司.Na3 PO4 ，CaCl2 ，EDTA，MgCl2 均购自西安化学试剂厂.（NH4 ）2 SO4 购自天津南开化工厂.巴比妥酸购自北京芳草医药化工研制公司.CM-Sepharose6B，Sephadex G-25 和 DEAE-Sepharose 购自 Pharmacia Biotech.电泳仪
7、和色谱仪均购自 BIO RAD 公司.分光光度仪购自 Beckman. 1.2 方法 1.2.1 冷球蛋白沉淀 新鲜血浆 500mL，加入20mmolL-1 CaCl2 ，4过夜后，23000g 离心15min，取上清，加入 5gL-1 盐酸苯甲脒. 1.2.2 优球蛋白沉淀 上清液（pH5.5）作为透析内液，透析外液为 2L 含 5gL-1 盐酸苯甲脒的 5mmolL-1 4-EDTA（pH5.5 ） ，4过夜后，透析内液 23000g 离心 30min，取上清，加入 20mL0.4molL-1 Na3 PO4 （pH6.0） ，5mL0.2molL-1 -EDTA（pH6.0）和 0.1m
8、L 甲苯. 1.2.3 离子交换色谱 CM-Sepharose6B（20cm5cm）用0.1molL-1 Na3 PO4 （pH6.0 ）平衡，将样品上柱，用0.4molL-1 Na3 PO4 （pH6.0）洗脱，流速4.2mLmin-1 ，流动相中均含 5gL-1 盐酸苯甲脒. 回收活性成分. 1.2.4 硫酸铵沉淀 活性成分中按 291gL-1 加入（NH4 ）2 SO4 使其终浓度为 500gL-1 ，4搅拌，23000g 离心 30min.上清液过滤后，按 159gL-1 再加入（NH4 ）2 SO4 使其最终浓度为 750gL-1 ，30000g 离心 90min，弃上清. 沉淀中加
9、入 25mL 含5gL-1 盐酸苯甲脒的 0.4molL-1 Na3 PO4 （pH6.0） ，过夜使其再溶，30000g 离心 30min，取上清. 1.2.5 亲和色谱 CNBr 活化的 Sepharose4B 的合成: 将3.5g CNBr 溶解在 3.5mL 二甲基甲酰胺中，加入 25mL Sepharose4B 胶，将 pH 值调至 1011，20搅拌.用0.1molL-1 Na3 PO4 （pH7.8）充分冲洗，并在100mL 相同的缓冲液中，4搅拌过夜.上柱:Sephadex G-525（20cm2.6cm）用巴比妥缓冲液（5mmolL-1 Veronal，0.5mmolL-1
10、CaCl2 ，2.0mmolL-1 MgCl2 和 0.04molL-1 NaCl，pH8.5）平衡，将样品上柱，收集活性峰.CNBr 活化的 Sepharose4B（15cm1cm ）用上述缓冲液平衡后上样，用 0.4molL-1 Na 3 PO4 （pH6.0 ）洗脱，流速 1.0mLmin-1 ，收集活性峰. 1.2.6 离子交换色谱 CM-Sepharose6B（5cm1cm）用0.1molL-1 Na3 PO4 （pH6.0 ）平衡，将样品稀释 4 倍后上柱，用 0.4molL-1 Na3 PO4 （pH6.0）洗脱，收集活性峰 100mL，-20冻存. 1.2.7 SDS-PAGE
11、 电泳 浓缩胶浓度为 40gL-1 ，分离胶浓度为 75gL-1 .其他同常规 SDS-PAGE 电泳. 1.2.8 C2 活性测定 将 0.5mL C2 稀释后，与 0.5mL 抗体、C1 和 C4 致敏的红细胞（108 mL-1 ）30 共育 5min;再将 1.5mL 豚鼠血清用 0.04molL-1 EDTA 稀释 30 倍，加入以上混合液，37孵育 1h，1000g 离心 10min.然后加入 5mL冷藏的 0.15molL-1 NaCl，根据上清的 A410 值判断溶血活性5 . 61.2.9 Lowry 法测定蛋白量 用 0.5mgmL-1 的BSA 作标准曲线，其他同常规 Lo
12、wry 法. 2 结果 优球蛋白沉淀后的样品上 CM-Sepharose6B（20cm5cm）柱（Fig1） ，收集之活性峰（ pool）上 CNBr 活化的 Sepharose4B 柱（Fig2）和再收集之活性峰上CM-Sepharose6B（5cm1cm）柱（Fig3）的 C2 色谱图.经SDS-PAGE 电泳（Fig4）证实条带单一的 C2 条带，最终测得比活为 17.341016 nKatg-1 ，C2 的蛋白含量为2.49mgL -1 . 图 1 图 2 略 3 讨论 C2 是一种 球蛋白，相对分子质量 Mr 100000，单链，含糖 159gL-1 ，沉降系数为 4.5S.C2 的
13、一级结构已经阐明，共有 732 个氨基酸 .人 C2 基因位于 6p31.2，全长 18kb，与另外 3个补体蛋白 B 因子、C4a 和 C4b 的基因紧密相关6 .C2 极易被C1s 裂解为 C2a 和 C2b，其相对分子质量分别为 Mr 70000 和30000，C2a 构成经典激活途径中 C3 转化酶的酶原部分，而 C3 的7活化是补体激活的关键步骤，它导致靶细胞最终被膜攻击复合物溶解5 .C2b 生物活性至今不明1 .为了明确 C2 的功能及其与某些疾病的关系，首先要得到纯度高、稳定性好的 C2 纯品. 图 3 图 4 略 为保持生物学活性、减少操作步骤、增加产率等原则，我们采用沉淀、
14、透析、盐析等方法，利用亲和色谱提纯倍数高、离子交换色谱容量高等优点，实现了对 C2 较好的分离7 .其中用优球蛋白沉淀除去了 C1，用 CM-Sepharose6B 柱和硫酸铵沉淀除去了血清中的白蛋白.C2 与 B 因子性质相似，但浓度仅为20mgL-1 ，比 B 因子低 10 倍， B 因子直接导致 C2 的产率降低.实验中利用 CNBr 活化的 Sepharose 4B 柱在低盐环境中（0.1molL-1 Na 3 PO4 ）可与 C2 特异性结合，在高盐环境中（0.4molL-1 Na3 PO4 ）被洗脱的特点8 ，成功地除去大部分 B 因子.C2 裂解片段是提纯过程中的另一种污染物，通
15、过反复加入盐酸苯甲脒，特别是在纯化早期，有效地抑制了 C2 蛋白的水解.我们对参考文献中的几种方法进行综合、简化并加以改进，得出具体的纯化步骤.实验结果也表明: 在离子交换色谱及亲和色谱中用等浓度洗脱比文献中用梯度洗脱所需的时间短，仪器简单，分离效果好. 8最后，经 Lowry 法检测，本实验从 1000mL 血浆中提纯到了 2.49mg C2，与其血浆浓度相比，产率为 12.46%.总活性是43.3nKat1013 ，比活为 17.34nKat1016 g-1 ，与1000mL 血浆中 C2 总活性 31.7nKat1014 相比，活性回收率为13.68%.实验中的回收部分由电泳证实，最终所
16、得活性峰由电泳和活性测定得到证实.终产物在 pH 中性时稳定，且无需加入蛋白稳定剂. 方法简便，产率较高，适用于实验室研究和大规模制备. 参考文献: 1Jin BQ.Cellular and molecular immunology M.Xian:World Books Publising Company，1995:178-182. 2Zhao XZ，Tian YW.C2 An important molecule in the first activited path of complement J.Foreign Med Sci（Immunolo-gy ） ，1989;12 （4）:173-177. 3Polley MJ，Muller-Eberhard HJ.The second component of hu-man complement:Its
