《实验琼脂糖凝胶电泳的原理以及方案》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验琼脂糖凝胶电泳的原理以及方案（45页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、琼脂糖凝胶电泳的 原理和方法 一 电电泳方法的分类类 按支持物的物理性状不同 区带电带电 泳可为为 滤纸滤纸 及其他纤维纤维 如醋酸纤维纤维 玻璃纤纤 维维 聚氯氯乙烯纤维烯纤维 薄膜电电位 粉末电电泳 如纤维纤维 素粉 淀粉 玻璃粉电电 泳 凝胶电电泳 如琼琼脂 琼琼脂糖 硅胶 淀粉 胶 聚丙烯酰烯酰 胺凝胶等 丝线丝线 电电泳 如尼龙丝龙丝 人造丝电丝电 泳 按支持物的装置形式不同 区带电带电 泳可为为 平板式电电泳 支持物水平放置 是最常用 的电电泳方式 垂直板式电电泳 聚丙烯酰烯酰 胺凝胶常做成垂 直板式电电泳 垂直柱式电电泳 聚丙烯酰烯酰 胺凝胶盘盘状电电泳 即属于此类类 连续连续
2、液动动电电泳 首先应应用于纸电纸电 泳 将滤滤 纸纸垂直竖竖立 两边边各放一电电极 溶液自顶顶端 向下流 与电电泳方向垂直 概念 以琼琼脂糖凝胶作支持体的电电泳方式 二 琼琼脂糖凝胶电电泳 天然琼琼脂 agar 又名琼琼胶 菜燕 冻冻粉 从石花菜及 其它红红藻类类植物提取出来的一种线线状高聚物 琼琼脂糖 agarose 琼琼脂胶 agaropectin 天然琼琼脂 agar 是一种多聚糖 主要由琼琼 脂糖 约约占80 及琼琼脂胶组组成 琼琼脂糖是由 半乳糖及其衍生物构成的中性物质质 不带带 电电荷 而琼琼脂胶是一种含硫酸根和羧羧基的 强酸性多糖 由于这这些基团带团带 有电电荷 在 电场电场 作
3、用下能产产生较较强的电电渗现现象 加之 硫酸根可与某些蛋白质质作用而影响电电泳速度 及分离效果 琼琼脂糖链链依分子内和分子间氢键间氢键 及其它力的作 用使其互相盘绕盘绕 形成绳绳状琼琼脂糖束 构成大网孔型 凝胶 D D 半乳糖半乳糖3 3 6 6 脱水脱水 L L 半乳糖半乳糖 琼琼脂糖为电为电 泳支持物进进行平板电电泳 其优优点如下 1 琼琼脂糖凝胶电电泳操作简单简单 电电泳速度快 样样品不 需事先处处理就可进进行电电泳 2 琼琼脂糖凝胶结结构均匀 含水量大 约约占98 99 近似自由电电泳 样样品扩扩散度较较自由电电泳 小 对样对样 品吸 附极微 因此电电泳图谱图谱 清晰 分辨率高 重复性
4、好 3 琼琼脂糖透明无紫外吸收 电电泳过过程和结结果可直接 用紫外光灯监测监测 及定量测测定 4 电电泳后区带带易染色 样样品易洗脱 便于定量测测定 制成干膜可长长期保存 琼琼脂糖凝胶电电泳的缺点 1 机械强度差 易破碎 浓浓度不能太低 2 易被细细菌污污染 不易保存 临临用前配制 3 琼琼脂糖支持层层上的区带带易于扩扩散 电电泳后必 须须立即固定染色 4 与PAGE相比 分子筛筛作用小 区带带少 目前 琼琼脂糖凝胶电电泳常用于分离 鉴鉴定核酸 如DNA鉴鉴定 DNA限制性内切酶图谱图谱 制作等 由于这这种方法操作方便 设备简单设备简单 需样样品量少 分辨能力高 已成为为基因工程研究中常用实验
5、实验 方法之一 琼琼脂糖也可用作为电为电 泳支持物 分离蛋白质质和 同工酶 将琼琼脂糖电电泳与免疫化学相结结合 发发展 成免疫电电泳技术术 能鉴别鉴别 其他方法不能鉴别鉴别 的复 杂杂体系 由于建立了超微量技术术 0 1 g蛋白质质就 可检检出 琼琼脂糖凝胶电电泳对对核酸的分离作用主要 依据它们们的相对对分子质质量及分子构型 同 时时与凝胶的浓浓度也有密切关系 三 DNA的琼琼脂糖凝胶电电泳 1 核酸分子大小及琼琼脂糖的浓浓度的关系 1 DNA分子的大小 DNA分子在琼琼脂糖凝胶中泳动时动时 有电电荷效应应 和分子筛筛效应应 DNA分子在高于等电电点的pH 溶液中带负电带负电 荷 在电场电场
6、中向正极移动动 在一 定的电场电场 强度下 DNA分子的迁移速度取决于 分子筛筛效应应 即DNA分子本身的大小和构型 在凝胶中 DNA片段迁移距离 迁移率 与碱基 对对的对对数成反比 因此通过过已知大小的标标准物 移动动的距离与未知片段的移动动距离进进行比较较 便可测测出未知片段的大小 但是当DNA分子大小超过过20kb时时 普通琼琼脂 糖凝胶就很难难将它们们分开 此时电时电 泳的迁移率 不再依赖赖于分子大小 因此 应应用琼琼脂糖凝胶 电电泳分离DNA时时 分子大小不宜超过过此值值 2 琼琼脂糖的浓浓度 不同大小的DNA需要用不同浓浓度的琼琼脂糖凝胶 进进行电电泳分离 如下表所示 2 核酸构型
7、与琼琼脂糖凝胶电电泳分离的关系 不同构型DNA的移动动速度次序为为 共价闭环闭环 DNA covalently closed circular 简简称cccDNA 直 线线DNA 开环环的双链环链环 状DNA 当琼琼脂糖浓浓度太高时时 环环状DNA 一般为为球形 不能进进入胶中 相对对迁移率为为 0 Rm O 而同等大小的直线线双链链DNA 刚刚性棒状 则则可 以 长轴长轴 方向前进进 Rm O 由此可见见 这这3种构型的相 对对迁移率主要取决于凝胶浓浓度 但同时时 也受到电电流强 度 缓缓冲液离子强度等的影响 3 电电泳方法 1 凝胶类类型 用于分离核酸的琼琼脂糖凝胶电电泳可分为为垂直型 及
8、水平型 平板型 水平型电电泳时时 凝胶板完全浸 泡在电电极缓缓冲液下1 2mm 故又称为为潜水式 目 前更多用的是后者 因为为它制胶和加样样比较较方便 电电泳槽简单简单 易于制作 又可以根据需要制备备不 同规规格的凝胶板 节约节约 凝胶 因而受到人们们的欢欢 迎 2 缓缓冲液系统统 缺少离子时时 电电流太小 DNA迁移慢 相反 高 离子强度的缓缓冲液由于电电流太大会大量产热产热 严严 重时时 会造成胶熔化和DNA的变变性 常用的电电泳缓缓冲液有EDTA pH8 0 和Tris 乙酸 TAE Tris 硼酸 TBE 或Tris 磷酸 TPE 等 浓浓 度约为约为 50mmol L pH7 5 7
9、 8 电电泳缓缓冲液一般 都配制成浓浓的贮备贮备 液 临临用时时稀释释到所需倍数 TAE缓缓冲能力较较低 后两者有足够够高的缓缓冲能力 因此更常用 TBE浓浓溶液长长期贮贮存会出现现沉 淀 为为避免此缺点 室温下贮贮存5 溶液 用时时稀释释 10倍 0 5 工作液也可提供足够够的缓缓冲能力 3 凝胶的制备备 以稀释释的电电极缓缓冲液为为溶剂剂 用沸水浴或微 波炉配制一定浓浓度的溶胶 冷却至45 50 时时灌 入水平胶框或垂直胶膜 插入梳子 自然冷却 4 样样品配制与加样样 DNA样样品用适量Tris EDTA缓缓冲液溶解 缓缓 冲溶解液内含有0 25 溴酚蓝蓝或其他指示染料 含有10 15 蔗
10、糖或5 10 甘油 以增加 其比重 使样样品集中 为为避免蔗糖或甘油可能 使电电泳结结果产产生U形条带带 可改用2 5 Ficoll 聚蔗糖 代替蔗糖或甘油 5 电电泳 琼琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验实验 条件的研究结结果表 明 在低浓浓度 低电压电压 下 分离效果较较好 在低电压电压 条件下 线线性DNA分子的电电泳迁移率与所用的电压电压 呈 正比 但是 在电场电场 强度增加时时 较较大的DNA片段迁 移率的增加相对较对较 小 因此随着电压电压 的增高 电电泳分 辨率反而下降 为为了获获得电电泳分离DNA片段的最大分 辨率 电场电场 强度不宜高于5V cm 电电泳系统统的温度对对于DNA在
11、琼琼脂糖凝胶中的电电泳行 为为没有显显著的影响 通常在室温下进进行电电泳 只有当 凝胶浓浓度低于0 5 时时 为为增加凝胶硬度 可在4 进进行电电泳 6 染色和拍照 常用荧荧光染料溴乙锭锭 EB 染色 在紫外光下观观察 DNA条带带 用紫外分析仪仪拍照 或用凝胶成像系统输统输 出照片 并进进行有关的数据分析 注意 溴化乙锭锭 EB 为为强致癌剂剂 操作时应时应戴手 套 尽量减少台面污污染 目前实验实验室一般用相对对安全的GoldenView等 核酸荧荧光染料代替 四 印迹转转移电电泳 生物化学与分子生物学的研究工作经经常需要对电对电 泳分离 后的DNA进进行分子杂杂交 但琼琼脂糖不适合于进进行
12、杂杂交操作 1975年 Southern创创造了将DNA区带带原位转转移到硝酸基 纤维纤维 素膜 NC膜 上 再进进行杂杂交的方法 被称为为Southern 印迹法 随后 Alwine等将类类似方法用于RNA印迹 被戏戏 称为为Northern印迹 1979年Towbin等设计设计 了将蛋白质质从凝 胶转转移到硝酸纤维纤维 素膜的装置 将蛋白质转质转 移到膜上 再 与相应应的抗体等配体反应应 被戏戏称为为Western印迹 这这种 装置将膜和凝胶 滤纸滤纸 等制成夹夹心饼饼干状 用低电压电压 高电电 流电电泳完成转转移 1982年Reinhart等用电转电转 移法将等电电聚 焦后的蛋白质质区带
13、带从凝胶转转移到特定膜上 称Eastern印迹 目前国内外有多种核酸 蛋白质质印迹转转移的电电泳装置出 售 使印迹转转移速度快 效率高 重复性好 应应用更加广泛 仪仪器的使用方法可参照厂家说说明书书 聚丙烯酰烯酰 胺凝胶也可用 于印迹转转移电电泳 但转转移蛋白质时质时 凝胶中不可含有SDS 尿素等变变性剂剂 用于转转移电电泳的支持膜亦有多种选择选择 近些 年用尼龙龙膜较较多 因为为尼龙龙膜机械性能好 烘烤不变变脆 使 用时时比硝酸纤维纤维 素膜更方便 进进行印迹转转移电电泳时时 要注意缓缓冲液的离子强度要低 pH 要远远离pI 使蛋白质带质带 有较较多电电荷 一般用稳稳定性较较好的 Tris
14、缓缓冲体系 还还要注意凝胶与支持膜之间间不能有气泡 适 当提高电压电压 或电电流可以提高转转移速度 但亦会增加热热效应应 故电压电压 或电电流不可过过高 一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA 这是因为在琼脂糖凝胶中 DNA分子的有效直径 超过凝胶孔径时 在电场作用下 迫使DNA变形挤 过筛孔 而沿着泳动方向伸直 因而分子大小对迁 移率影响不大 如此时改变电场方向 则DNA分子 必须改变其构象 沿新的泳动方向伸直 而转向时 间与DNA分子大小关系极为密切 五 交变变脉冲电场电场 凝胶电电泳 1983年 Schwartz等人根据DNA分子弹性弛豫 时间 外推为零的滞留时间 与DNA分子大
15、小有关的 特性 设计了脉冲电场梯度凝胶 交替采用两个垂 直方向的不均匀电场 使DNA分子在凝胶中不断改 变方向 从而使DNA按分子大小分开 后来 Carle 等改进了电泳技术 并发现周期性的反转换电场 periodic inversion of the electric field 亦能使大 分子DNA通过电泳分开 电泳系统是由一个水平式 电泳槽和两组独立 彼此垂直的电极组成 一组电 极负极为N 正极为S 另一组负极为W 正极为E 一块正方形琼脂糖凝胶板 10cm 10cm或 20cm 20cm 呈45 置于中央 电场在N S和W E之间交 替建立 电场交替改变的时间长短与欲分离的DNA分子大
16、 小有关 电泳时 DNA分子处在连续间隔交替的电场中 首先向S极移动 然后改向E极 在每次电场方向改变时 DNA分子就要有一定的时间松弛 改变形状和迁移方向 只有当DNA分子达到一定构型后 才能继续前进 DNA 分子净移动方向与加样线 图中点线 垂直 使样品中各组 分沿同一泳道形成各自的区带 交变脉冲电泳可有效分离 数百万bp的大分子DNA 较新式的仪器电极间的 角度和 脉冲时间均可调 使用更加方便 按电电泳法分 按超速离心法分 乳糜微粒 CM 乳糜微粒CM pI 各种脂蛋白均带负电 电泳时由负 极到正极 VLDL为圆形 受阻力小 LDL形态不 规则 受阻力大 所以VLDL跑在前 加样槽加样槽 前 前 CM LDL VLDL HDLCM LDL VLDL HDL 临床应用 高脂蛋白血症的分型 CM 前 正常 型 a型 b型 型 型 型
