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1、实验四 尿标本的微生物学检验 1 2019 11 26 实验目的 掌握尿液标本的采集与处理 常见病原菌 及一般微生物学检验程序和细菌计数方 法 掌握大肠杆菌 产气杆菌 变形杆菌的微 生物学鉴定方法和生物学性状 2 2019 11 26 尿标本的采集与处理 正常人的尿液通常是无菌的 但在外尿道除有 正常菌群外 尚有其他一些病原菌和条件致病 菌 可通过多种途径引起尿路感染 urinary tract infection UTI 如 葡萄球菌 链球 菌 肠球菌 大肠埃希氏菌 变形杆菌等 标本采集方法常有五种 导尿法 中段尿采集 法 肾盂尿采集法 膀胱穿刺采集法 留尿 法 3 2019 11 26 1
2、 导尿法 采取导尿管导尿 是一种较好的无菌采集法 可直接 插导管采集尿液标本或滞留导管集尿 直接导尿先让尿流弃 15ml 滞留导管集尿先用70 酒精消毒导管口再用针筒抽取 取尿量为10 15ml 直接导尿有将尿道细菌进入膀胱的危险 尽量避免此方法 2 中段尿采集法 目前国内临床常用此法 女性病人先用肥皂水 或1 1000高锰酸钾水溶液冲洗外阴及尿道口 男性病人应翻转 包皮冲洗 用1 1000新洁尔灭消毒尿道口 用无菌生理盐水或 无菌水冲去消毒液 再用灭菌纱布擦干 让病人排尿 弃去前 段尿 收集中段尿10 20ml 置于无菌容器内 立即加盖送 检 4 2019 11 26 3 肾盂尿采集法 由泌
3、尿科医生在膀胱镜下分别采 集左右侧输尿管的尿液 并做好标记 以防左右侧 错位 尿液采集量不少于1ml 4 膀胱穿刺采集法 在病人耻骨上膀胱区用碘酒 酒精消毒 要求病人不排尿充盈膀胱 以无菌针筒 做膀胱穿刺 抽取尿液后针筒插入橡皮塞送检 此 法主要用于厌氧培养 5 留尿法 疑为尿道结核患者 可用一洁净容器 留取24h尿液 取其沉淀部分盛于清洁瓶内送检 5 2019 11 26 通常取晨起第一次尿送检 由于治疗所用药物多数均通过尿液排泄 因此 无论 用何种方法采集尿液都宜在用药前进行 尿液标本的采取和培养最大的问题是污染杂菌 故应 严格进行无菌操作 尿液标本中不得加防腐剂 否则会影响检出的阳性 率
4、 尿液标本采集后要立即送检 常规2h内 或存放于 4 冰箱 不超过24h 教材规定为8h 因搁置时间 稍长尿中病原菌可在室温中增殖 而影响细菌计数的 正确性 应注意淋病奈瑟菌培养时标本不能冷藏保 存 6 2019 11 26 常见病原菌 医院内引起UTI的病原菌70 为革兰氏阴性 杆菌 其中以肠杆菌科和假单胞菌属的细菌为 主 革兰氏阳性菌约占20 其中以葡萄球菌 和肠球菌为多见 由于抗菌素的广泛应用 近 年来真菌性UTI增多 约占10 7 2019 11 26 检验程序 尿标本 直接涂片染色 分离培养 细菌计数 直接药敏试验 特殊细菌检查离心沉淀 BA 中国蓝或麦康凯平板 常规培养 血清学鉴定
5、 生化鉴定 药敏试验 确定病原菌 定量培养 直接计 数 35 18 24h 观察菌落形态 涂片染色镜检 发报告 8 2019 11 26 检验程序 革兰阴性杆菌 氧化酶 Oxi 肠杆菌科细菌 非发酵菌 氧化酶阴性非发酵菌 不动杆菌 嗜麦芽窄食单胞菌 氧化酶阳性其他革兰阴性菌 巴斯德菌 气单胞菌 邻单胞菌 和弧菌属等也是氧化酶阳性 9 2019 11 26 麦康凯平板 Mac 是一种肠道杆菌专用的弱选择性培养基 培养基 成分中除基础成分外 主要含有0 5 胆盐 1 乳 糖 中性红指示剂 胆盐 一方面对沙门氏菌有刺激生长作用 另一方 面对革兰氏阳性菌及大肠埃希氏菌有抑制作用 1 乳糖 作为一种指示
6、糖 中性红指示剂 pH6 8 8 4 由红 黄 分解乳糖的细菌产酸 使菌落周围胆盐堆积变浑浊 10 2019 11 26 实验器材 1 标本 1 2 3 模拟尿液标本 2 培养基 BA Mac 普通营养琼脂 KIA 蛋白胨水 葡萄糖蛋白胨水 枸橼酸盐斜面 尿素 苯丙氨酸斜 面 硝酸盐蛋白胨水 3 试剂 9 9ml无菌生理盐水 革兰染液 氧化酶试剂 3 H2O2 靛基质试剂 甲基红试剂 VP甲液 VP乙 液 10 FeCl3 硝酸盐还原试剂甲液 硝酸盐还原试剂 乙液 4 其它 无菌空平皿 载玻片等 11 2019 11 26 实验方法 一 分离培养 用无菌方法将1 2 3 模拟尿液标本分别划线接
7、种于BA Mac上 置35 培养18 24小时 二 直接涂片染色 取上述1 2 3 标本分别作涂片 革兰氏染色 镜检 要 求绘图并描述 三 细菌计数 倾注平板法 0 1ml尿液 9 9ml无菌NS 混匀 取0 1ml 1 1000稀释 标本 无菌空平皿 倾入10 15ml加热融化并 冷至50 的无菌营养琼脂 混匀 35 培养18 24h 12 2019 11 26 0 1ml 尿液 9 9ml NS 1 100稀释标本0 1ml 总稀释倍数1 1000 13 2019 11 26 四 结果观察 1 细菌计数 1 结果记录 2 结果计算 每ml尿液细菌数 菌落平均数 稀释倍数 3 结果判断标准
8、尿标本中细菌的计数 主要是根据尿中细菌的多少来判断是否感 染 一般认为 细菌计数 104 ml为污染 105 ml为感染 104 105 ml为可疑 14 2019 11 26 目前认为由革兰氏阴性杆菌引起的菌尿 其菌数均可达到 105 ml 而球菌所引起的菌尿 其菌数达到104 ml 即可作为尿 路感染的标准 因不同细菌繁殖速度快慢不一 在同一时间内 细菌繁殖数应该是 革兰氏阴性杆菌 葡萄球菌 肠球菌 为此 作菌尿计数时 必须与涂片染色结果结合 作出报告 以下几种情况均可使尿液中菌数 104 ml 1 应用了低敏感性抗菌药物 尿液中细菌受到一定抑制 2 患者大量输液或使用利尿剂后 3 尿液p
9、H值失常 当pH 5 8或pH 8 5时 细菌生长受阻 4 尿频时 膀胱内的菌停留时间短则细菌数少 5 某些菌的繁殖能力低 15 2019 11 26 2 菌落形态描述 BA Mac分别描述 1 标本 2 标本 3 标本 3 菌体形态观察 分别取1 2 3 标本的BA Mac培养物涂片 革兰染 色 镜检 要求绘图并描述 对比BA Mac菌体形态 差异 BA Mac 16 2019 11 26 五 鉴别试验 1 氧化酶 Oxidase 试验 原理 氧化酶又称细胞色素氧化酶 是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸 酶 氧化酶试验中 酶并不直接与试剂 1 盐酸四甲基对苯二胺或 1 盐酸二甲基对苯二胺 起反应
10、 而是首先使细胞色素c氧化 然 后氧化型细胞色素c使对苯二胺氧化 出现显色反应 试剂 1 盐酸四甲基对苯二胺或 1 盐酸二甲基对苯二胺 方法 直接法和试剂纸片法 直接法 用滤纸片刮取待检菌菌落 切勿刮到培养基 在有菌的 位置滴加氧化酶试剂 1分钟内观察结果 结果判断 立即出现红色 继而逐渐加深为阳性 盐酸四甲基对苯二 胺呈现蓝紫色为阳性 不变色为阴性 17 2019 11 26 意义 本试验应用广泛 如奈瑟菌属 假单胞 菌属 莫拉菌属呈阳性 肠杆菌科细菌呈 阴性 2 触酶试验 18 2019 11 26 六 生化鉴定 将1 2 3 标本分别接种于KIA 蛋白胨水 葡萄糖蛋白胨水 枸橼酸盐 斜面
11、 尿素 苯丙氨酸斜面 硝酸盐蛋白 胨水中 置35 培养18 24小时 19 2019 11 26 1 KIA 克氏双糖铁 试验 原理 1 营养非常丰富 2 葡萄糖 乳糖 1 10 3 指示剂为酚红 变色范围6 0 8 6 pH8 6显红色 4 含有硫代硫酸钠 5 含有Fe 2 方法 直接观察结果 20 2019 11 26 只分解葡萄糖 分解葡萄糖和乳糖 产生气体 产生H2S 结果 判断 21 2019 11 26 22 2019 11 26 结果表示 不产酸 产酸 产酸产气 产酸A 产碱K 斜面 底层 H2S 斜面 底层 H2S 产气 A A K A 23 2019 11 26 2 吲哚 靛
12、基质 试验 原理 色氨酸 色氨酸酶 吲哚 丙酮酸 和氨 对二甲基氨基苯 甲醛 玫瑰吲哚 吲哚 24 2019 11 26 方法 结果 应用 用于肠杆菌科细菌的鉴定 25 2019 11 26 3 甲基红试验 MR试验 4 VP试验 26 2019 11 26 原理 变色范围4 4 6 2 27 2019 11 26 方法及结果 28 2019 11 26 甲基红实验结果 阴性 阳性 29 2019 11 26 VP实验结果 阳性 阴性 30 2019 11 26 应用 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定 MR VP 大肠埃希菌 产气肠杆菌 31 2019 11 26 IMViC I 吲哚试验 M 甲基
13、红试验 V V P试验 C 枸橼酸盐利用试验实验 32 2019 11 26 5 枸橼酸盐利用试验 原理 某些细菌能利用培养基中的枸橼酸钠作为唯一 的碳源而获得能量 能利用枸橼酸盐的细菌也能利 用铵盐作为唯一氮源 同时产生氨 分解枸橼酸盐 使培养基变碱性 方法 直接观察结果 应用 肠杆菌科细菌的鉴定 33 2019 11 26 34 2019 11 26 6 尿素酶试验 原理 产生尿素酶的细菌 分解培养基中的尿素 产 生碳酸铵是培养基pH 酚红由浅红色变成深红色 35 2019 11 26 方法 直接观察结果 结果 反应时间因细菌而异 培养基变 成深红色为阳性 应用 肠杆菌科细菌的鉴定 36
14、2019 11 26 7 苯丙氨酸脱氨酶试验 原理 37 2019 11 26 方法 待检菌大量接种于苯丙氨酸 琼脂斜面上 培养后在斜面上 直接加4 5滴10 氯化铁试剂 出现绿色为阳性 立即观察 为可逆反应 38 2019 11 26 39 2019 11 26 8 硝酸盐还原试验 原理 有些细菌具有还原硝酸盐的能力 可将硝酸盐还 原为亚硝酸盐 氨或氮气等 亚硝酸盐与硝酸盐还原 试剂中的醋酸作用生成亚硝酸 亚硝酸与试剂中对氨 基苯磺酸作用 生成重氮苯磺酸 重氮苯磺酸与 萘 胺结合成红色的N 萘胺偶氮苯磺酸 方法 在硝酸盐蛋白胨水培养物中分别滴加硝酸盐还原 试剂甲液和乙液各1 2滴 混匀 立即
15、观察结果 40 2019 11 26 阳性 加入试剂后30s变成红色 表明有亚硝酸盐存在 表示硝酸盐还原试验阳性 阴性 加入试剂后没有颜色反应 可能是 硝酸盐没有被还原 真阴性反应 硝酸盐被还原成非亚硝酸盐的其他产物 如NH3 N2 脱硝作用 NO或N2O和羟胺等 由于此试剂只检测亚 硝酸盐 上述产物会导致假阴性结果 因此 需要加 少量锌粉于阴性反应中 锌离子还原硝酸盐为亚硝酸 盐 加入锌粉后变成红色 表示有剩余的硝酸盐存在 证明是真正的阴性反应 结果判断 41 2019 11 26 42 2019 11 26 应用 肠杆菌科除某些生物型与欧文菌属外 均还原硝酸盐为 亚硝酸盐 铜绿假单胞菌 嗜
16、麦芽假单胞菌等假单胞菌可产生 氮气 需加入锌粉证实 阳性对照菌为大肠埃希菌 阴性对照 菌为醋酸钙不动杆菌无硝变种 43 2019 11 26 菌名 KIA 硝 酸 盐 还 原 试 验 吲 哚 甲 基 红 MR V P 枸 橼 酸 盐 Cit 脲 酶 Ure 苯丙 氨酸 脱氨 酶 Pad 氧 化 酶 试 验 触 酶 试 验 乳 葡H2S 气 体 Gas 大肠 艾希 菌 A A 产气 肠杆 菌 A A 变形 杆菌 K A 七 实验结果 44 2019 11 26 结果报告 1 标本检出 2 标本检出 3 标本检出 45 2019 11 26 实验讨论 作业 1 查5篇关于尿标本检验常见病原菌文献 例出 文献名及每篇文献中前五种常见菌 2 尿液标本分离培养选择Mac的目的 3 产气肠杆菌尿素酶试验出现假阳性的可能原 因 46 2019 11 26 实验讨论 作业 1 查5篇关于尿标本检验常见病原菌文献 例出 文献名及每篇文献中前五种常见菌 2 尿液标本分离培养选择Mac的目的 3 产气肠杆菌尿素酶试验出现假阳性的可能原 因 47 2019 11 26 实验讨论 作业 1 查5篇关于尿标本检验
