细胞工程PPT课件.ppt

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1、细胞群体倍增时间 定义 计算方法 1 得到细胞密度与时间的数据 1 2 3 细胞株与细胞克隆 定义 细胞株 Cell Strain 通过选择法 或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获 得具有特殊性质或标志物的培养物称为细 胞株 Cell Strain 也就是说 细胞株是 用单细胞分离培养或通过筛选的方法 由 单细胞增殖形成的细胞群 细胞株的特殊 性质或标志必须在整个培养期间始终存在 4 细胞培养板 6孔 12孔 24孔 48孔 96孔 5 饲养层法 饲养层细胞的制备 有限稀释法 6 同步培养 7 8 大规模培养 9 10 11 传代注意事项 接种数量为5 104 8 105个 ml 传代密度太低

2、 细胞容易死亡 表现出细胞在达到 增长前有较长的滞留期 培养液由于pH下降而呈现黄色 表明细胞已经达到 最大密度需要换液或进行传代培养 如果是单层贴壁的细胞 等长满培养瓶表面 即可 进行传代 12 u 二倍体细胞 培养细胞染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数 相同或基本相同 2n细胞占75 或80 以上 的细胞群 称二倍体细胞培养 二倍体细胞在正常情况下具有 限生命期 故属有限细胞系 13 对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称 细 胞的命名无严格统一规定 大多采用有一定意义缩写字或代 号表示 但不论什么形式 均不宜太长 以便记忆和了解 今列举以下几种代表性的细胞名称供参考 u HeL

3、a 为供体患者的性名 来源于宫颈癌 u CHO 中国地鼠卵巢细胞 Chinese Hamster Ovary u 宫 743 宫颈癌上皮细胞 1974年3月建立 u NIH3T3 美国国立卫生研究所 National Institute of Health 建立 u 细胞系或细胞株的命名 14 第五章 细胞融合与单克隆抗体 15 第一节 细胞融合概述 16 细胞融合 cell fusion 又称体细胞杂交 somatic hybridiazation 或细胞杂交 cell hybridiazation 是指在离体条件下将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞 通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术

4、 一 细胞融合的定义 17 Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞 Virchow于1858年描述了正常组织 发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物 蛙类 的血液细胞发生融合的过程 Cienkawski 1876 Buck 1877 Geddes 1880 在无脊椎动中发现了细胞合并现象 1958年日本学者冈田 Okada 发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇 PEG 化学融合法 1975

5、年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定 单克隆抗体的杂交瘤细胞 20世纪80年代出现了电融合技术 二 细胞融合研究历史 18 生物种类细胞来源成功年代 烟草两个种间 苷蓝 青菜 大豆 马唐草 矮牵牛 龙面花 大麦 花生 大麦 大豆 小麦 矮牵牛 油菜 大豆 玉米 大豆 大豆 野豌豆 大麦 蚕豆 大豆 草香木犀 酵母菌 鸡 大豆 烟草 大豆 秋水仙 人 胡萝卜 番茄 马铃薯 人 小鼠 叶 叶 叶 根 愈伤组织 叶 叶 花瓣 种子 种子 叶 悬浮细胞 叶 花瓣 叶 悬浮细胞 叶 悬浮细胞 悬浮细胞 悬浮细胞 叶 根 悬浮细胞 叶 原生质体 血红细胞

6、 悬浮细胞 叶 悬浮细胞 叶 腹水癌细胞 原生质体 叶 根尖 纤维肉瘤细胞 畸胎瘤细胞 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 几种细胞融合成功的例子 19 三 动植物细胞的融合过程 植物细胞融合过程人造小鼠培育过程示意图 20 四 细胞融合的意义 u理论上说任何细胞 都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源 这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义 u融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制 为远缘物种间 的遗传物质交换提供了有效途径 u体细胞

7、杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统 在杂种的分 裂和增殖过程中双亲的叶绿体 线粒体DNA亦可发生重组 从而产生新 的核外遗传系统 u淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备 21 第二节 细胞融合的基本原理 22 显微镜下细胞融合过程 23 融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解 24 第三节 细胞融合的常用方法 25 一 仙台病毒法 仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段 两种细胞在一起培养 加入病毒 在4 条件下病毒附着 在细胞膜上 并使两细胞相互凝聚 在37 中 病毒与细胞膜发生反应 细胞膜受到破环 此 时需要Ca2 和Mg2 最适PH为8 0一8 2 细胞膜连接部穿通

8、周边连接部修复 此时需Ca2 和 ATP 融合成巨大细胞 仍需ATP 26 病毒促使细胞融合的主要步骤如下 1 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近 2 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜 间互相渗透 胞质互相渗透 3 两个原生质体的细胞核互相融合 两个细胞融为一 体 4 进入正常的细胞分裂途径 分裂成含有两种染色体 的杂种细胞 27 用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 28 u 优点是易得 用法简单 融合效果稳定 u聚乙二醇 PEG 结构为 HOH2C CH20CH2 nCH2OH 分子量大 于 200小于6000者均可用作细胞融合剂 uPEG浓度以W W 如将10克P

9、EG与10mlEagLe氏液混合 假定 1ml 培养液为1g重 即成50 PEG溶液 uPEG经高压灭菌后 与温热的Engle氏液混合 u通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好 50 PEG溶液能产生 最多杂交细胞 uPEG溶液在pH6 0时细胞融合率最高 二 聚乙二醇 PEG 法 29 聚乙二醇 PEG 法细胞融合过程 30 PEG的作用机理 Kao等认为 由于PEG分子具有 轻微的负极性 故可以与具有正极性基团的水 蛋白质 和碳水化合物等形成H键 从而在在质膜之间形成分子 桥 其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合 另外 PEG能增加类脂膜的流动性 也使细胞的核 细胞器发生融合

10、成为可能 PEG诱导融合的特点 其优点是融合成本低 勿需特殊设备 融合子产生的异核率较高 融合过程不受物种限制 其缺点是 融合过程繁琐 PEG可能对细胞有毒害 31 32 33 聚乙二醇 PEG 法细胞融合步骤 1 将两种不同亲本细胞各5 l06混匀 2 离心沉淀 吸去上清液 3 加1ml 50 PEG溶液 用吸管吹打 使之与细胞接触1分钟 4 加9ml 培养液 离心沉淀 吸去上清液 5 加5ml 培养液 分别接种5个直径60mm平皿 每个平皿加培 养 液至 5ml 37 的CO2培养箱中培养 6 6 24小时后 换成选择培养液筛选杂交细胞 34 三 电融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合

11、技术 在直流电脉冲的 诱导下 细胞膜表面的氧化还原电位发生改变 使异种细胞粘 合并发生质膜瞬间破裂 进而质膜开始连接 直到闭和成完整 的膜 形成融合体 电融合法的优点 u融合率高 重复性强 对细胞伤害小 u装置精巧 方法简单 可在显微镜下观察或录像观察融合过程 u免去PEG诱导后的洗涤过程 诱导过程可控性强 35 电融合的基本过程 细胞膜的接触 当原生质体置于电导率很低的溶液中时 电场通 电后 电流即通过原生质体而不是通过溶液 其结果是原生质体在 电场作用下极化而产生偶极子 从而使原生质体紧密接触排列成串 膜的击穿 原生质体成串排列后 立即给予高频直流脉冲就可以 使原生质膜击穿 从而导致两个紧

12、密接触的细胞融合在一起 36 37 电融合诱导法原理示意图 1 8KV for bacteria transformation 38 第三节 杂种细胞的筛选 根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型 可将其 分为以下几种类型 u异核细胞 非同源细胞的融合体 u同核细胞 两个相同细胞的融合体 u多核细胞 含有双亲不同比例核物质的融合体 39 u基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 u基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选 u由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选 u具有所需性状杂种细胞的筛选 常用的杂种细胞筛选方法 40 第四节 细胞杂交瘤技术与单克隆抗体 41 一 何谓单克隆抗体 42 抗体 是

13、指能与相应抗原特异性 结合具有免疫功能的球蛋白 抗体的产生 机体免疫系统受抗 原刺激后 B淋巴细胞被活化增殖 和分化为浆细胞 由浆细胞合成和 分泌的球蛋白 43 44 45 46 McAb and PcAb 47 只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体 48 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞 myeloma cell 与 经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞 antigen stimulated B lymphoblast 融合得到杂交瘤细胞 hybridoma cell 杂 交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖 又具有B淋 巴细胞产生特异性抗体的能力 因此 单克隆抗体技术又称 为杂交

14、瘤技术 hybridoma technology 49 G Kohler C Milstein 50 二 杂交瘤技术的基本原理 51 三 杂交瘤细胞的制备 一 骨髓瘤细胞选择及选择性培养基 骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体 选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖转移酶缺陷型 HGPRT 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 TK 52 细胞DNA合成一般有两条途径 主途径 由糖和氨基酸合成核苷酸 进而合成DNA 叶酸 作为重要的辅酶参与这一合成过程 辅助途径 是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下 经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 HGPRT 和胸腺嘧啶核苷 激酶 TK 的催化作用合成DNA 氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂 可阻断瘤细胞利

15、用正常途径合 成DNA 而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的 HGPRT 细胞株 所以不能在该培养基中生长 53 54 细胞DNA合成途经 1 替代途径 次黄嘌呤 H HGPRT 2 主要途径 氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸 谷 氨 酰 胺 A 尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK 3 次要途径 胸腺嘧啶核苷 T 55 HAT培养基 次黄嘌呤 hypoxanthine H 氨基喋呤 aminopterin A 胸腺嘧啶脱氧核苷 thymidine T 次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖转移酶缺陷型 HGPRT 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 TK 56 二 免疫小鼠 免疫程序是取6 8周龄Balb C健康鼠 基础免疫

16、2周 静脉再加 强免疫一次 3 5天后用于融合 免疫时是否采用佐剂和事先处理抗 原 要依抗原性的强弱而定 一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较 好 抗原量同样与抗原强弱有关 以IgG为例 第一次为l00 g 第二 次为50 g 免疫途径第一次可经腹腔注射 对于细胞性抗原不用佐剂 每次腹腔注射1 l06一1 107 57 58 三 脾细胞的制备 1 引颈处死小鼠 用酒精消毒体表 2 无菌条件下取出脾脏 剃除结缔组织和脂肪 用5ml无血清培养液冲洗一次 3 把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中 4 在脾中部切开一小口 用注射器芯从一端轻轻压挤 再用无血清培养液冲洗 令细胞通过纱网 收集入平皿中 或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养 液 反复抽吸数次方法获取细胞 再制成细胞悬液亦可 5 把细胞悬液注入50ml离心管中 加l0一20ml培养液 轻轻吹打数次 室温中 置5分钟 6 离心 800一1000转 分 计数 备用 59 四 细胞准备 1 收集骨髓瘤细胞 用无血清培养液洗3次 37 计数活力细胞 不少于90 2 收集小鼠脾细胞 用无血清培养液洗3次 37 并计细胞数和测定活