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1、1比较两类树突状细胞激活的肿瘤特异性 CTL 对肝癌荷瘤裸鼠的治疗作用作者：张希国，师建国，刘彦仿，阎庆国 【摘要 】 目的 研究人外周血不同来源的树突状细胞（dendritic cells，DC）光镜形态学、细胞超微结构及体内外诱导抗肿瘤免疫反应的差异。方法 联合应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF) 、白介素4 （IL4 ）及肿瘤坏死因子（TNF）从人外周血中培养出两类 DC；人肝癌细胞系 SMMC7721 细胞的可溶性肿瘤抗原刺激两类 DC；两类 DC 激活同源的 T 淋巴细胞；观察两类 DC 激活的T 淋巴细胞分别抑制已接种于裸鼠的人肝癌细胞系 SMMC7721 移植瘤生长。结果
2、细胞因子诱导的人外周血 DC 群可见到两类 DC 亚群：一类可能来自 DC 前体细胞，另一类是由单核细胞分化来的DC；两类 DC 体外激活的 T 淋巴细胞能分别抑制肝癌细胞系SMMC7721 裸鼠移植瘤生长。结论 细胞因子诱导的人外周血DC 群存在多相性，两类 DC 亚群体内外诱导的抗肿瘤细胞免疫反应不仅能抑制肝癌细胞系 SMMC7721 裸鼠移植瘤发生，而且抑瘤率不同，提示两类 DC 亚群在肝癌的治疗中发挥着不同的作用。 【关键词】 树突状细胞；肝癌；肿瘤免疫；裸鼠2Antihepatocarcinoma Therapeutical Effect of Tumor Special CTL A
3、ctivated by Two Kind of Dendritic Cells in Nude MiceKey words：Dendritic cells；Hepatocellular carcinoma；Tumor immunity；Antitumor vaccine树突细胞(dendritic cells, DC) 是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC)，可以在体内外向 T 淋巴细胞提呈抗原，并诱发 CTL(细胞毒 T 淋巴细胞)反应。选择人外周血体外培养富集 DC 是研究 DC 的重要途径，但所面临的困难是 DC在外周血中含量极微
4、，而且 DC 的多源性和多功能性尚待进一步阐明。本实验我们借助于细胞因子诱导体外培养富集人外周血含量达70%80% DC 群，经形态学鉴定为两种 DC 群。体外分别诱导出针对肝癌细胞抗原的特异性，并用于荷瘤裸鼠的治疗以观察其抑瘤率的效果。1 材料与方法1.1 材料3重组人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF ） ，重组人白细胞介素4 （rhIL4 ） 、CD86(Sigma 公司） ，重组人肿瘤坏死因子（rhTNF ） （校肿瘤研究所馈赠） ，淋巴细胞分离液（上海华精生物科技有限公司） ，RPMI1640 、新生小牛血清（杭州四季青公司） ，MTT（华美生物工程公司） ，5 周龄雌性
5、BALB/c 裸鼠中国科学院上海实验动物研究所，动物饲养及实验在校实验动物中心（SPF 级动物实验室）完成，健康人外周血（附属医院输血科） 。1.2 方法1.2.1 DC 的体外培养及收集 据文献略作修改1 ，人外周血单个核细胞（PBMNC）以合适的密度接种于培养瓶内，适宜条件培养2h 后收集未贴壁细胞（97%以上 T 淋巴细胞，收集另培养） ，继续培养 24h 后按 3106 细胞/10ml 培养瓶分组：将释放下来的悬浮细胞作为 A 组，仍然贴壁的细胞作为 B 组，A 组及 B 组细胞均在含终浓度为 500u/ml 的 rhGMCSF（1 000u/ml）及rhIL4（500u/ ml）的上
6、述 RPMI1640 完全培养液中培养，A 组及 B 组均于培养第 3d 向培养瓶中添加 rhTNF（终浓度 500u/ml） ，每天半量换液，每隔 3d 全量换液（含上述 3 种细胞因子的培养液） ，于培养第 9d 收集 DC 群。1.2.2 两类 DC 亚群的透射电镜观察细胞超微结构 于培养第 124天收集足量 A、B 两组 DC 群,经 PBS 液洗 2 次后低速离心获细胞沉淀，经固定、脱水、包埋、超薄切片复染后，透射电镜观察并照相。1.2.3 两类 DC 亚群活化的 T 淋巴细胞对肝癌细胞的特异性杀伤 分别收集活化后的淋巴细胞，按每孔 5105、2.5105、5104 做效应细胞，靶细
7、胞分别为 SMMC7721 细胞、hepG2 细胞。靶细胞浓度为每孔 5105。同时做效应细胞和每种靶细胞的对照各 3 复孔。效应细胞与靶细胞混合培养 16h 后加入 5mg/ml MTT10l 继续培养 8h。离心培养板（2 000r/min，10min） ，弃去上清液，每孔加 DMSO100l，于 570nm 处测定 A 值计算各自实验结果。1.2.4 荷瘤裸鼠模型的建立 收集对数生长期的 SMMC7721 细胞，接种于裸鼠背部皮下，2106/只，抑瘤率由治疗初始肿瘤重量治疗结束时肿瘤重量/治疗初始肿瘤重量来表示。1.2.5 两类 DC 亚群诱导的肿瘤抗原特异性 CTL 治疗荷瘤裸鼠模型
8、15 只裸鼠中全部长出肿瘤。随机挑选 5 只荷瘤鼠为 A 群 DC 活化的肿瘤特异性 CTL1 治疗组，另选 5 只作为 B 群 DC 活化的肿瘤特异性 CTL2 治疗组，最后 5 只为阴性对照组。1.2.6 统计学方法 实验结果采用 SPSS 统计软件进行方差分析。52 结果2.1 人外周血来源的两类 DC 亚群的形态特征观测 在倒置显微镜下观察，A、B 两组培养第 34d 时可见大部分细胞呈梭形，细胞表面呈毛刺状，细胞大小约为单核细胞的 11.5 倍， A、B 两组细胞在数量及形态上无显著差异。2.2 两类 DC 亚群细胞超微结构 将体外培养第 12d 的 A、B 组DC 群样本在透射电镜
9、下观察，从亚细胞器的超微结构特征来看，DC 群含两类 DC：一类 DC 亚群在 A 组多见，其细胞表面有大量树枝状突起，细胞核形状不规则，核内异染色质沿核边高度凝聚，胞质中线粒体相当丰富，溶酶体、粗面内质网、胞饮小体数量少或无，见图 1a、b，这类 DC 中个别细胞表面树突粗大者，其胞浆内核糖体及光面内质网清晰可见，部分内质网扩张或有些线粒体膨胀，见图 1c，提示这些细胞活动度大、供能旺盛，我们分析这类 DC 可能源自 DC 前体细胞;另一类 DC 群在 B 组皆是，其细胞结构特征为细胞呈不规则形，细胞表面粗糙，有大量皱褶及粗大树枝结节状突起，细胞核常呈肾形或马蹄形，核内异染色质边集， 胞浆内
10、线粒体比第1 类 DC 群相对少，高尔基体及板层溶酶体较多，见图 2a、b 、c，我们分析这些可能是由单核细胞分化来的 DC 的超微结构特征。表1 两类 DC 亚群活化的 CTL 对 SMMC7721 表 2 两类 DC 诱导的6CTL 对 SMMC7721 移植廇抑瘤率的影响2.3 两类 DC 亚群活化的淋巴细胞对肝癌细胞的特异性杀伤 负载肝癌 SMMC7721 细胞可溶性抗原后两类 DC 亚群活化的 T 细胞，对 SMMC7721 细胞、hepG2 细胞均有不同程度的杀伤作用，见表 1，杀伤效果明显高于非特异性淋巴细胞对照组且由 B 群 DC活化的 CTL2 治疗组的杀伤效果高于由 A 群
11、 DC 活化的 CTL1 治疗组的杀伤效果。2.4 肝癌荷瘤鼠模型的建立 在接种后的 7 天内 15 只裸鼠全部长出肿瘤，荷瘤鼠平均重量变化及肿瘤平均重量，见表 2。2.5 两类 DC 亚群诱导的肿瘤抗原特异性 CTL1、CTL2 对荷瘤裸鼠模型的治疗作用观察 以被激活的 CTL 治疗裸鼠已生长出的SMMC7721 移植瘤，接种后的第 35 天对照组、A 群 DC 诱导的CTL1 治疗组及 B 群 DC 诱导的 CTL2 治疗组裸鼠的体重变化、移植瘤的重量变化、及抑瘤率，见表 1。其生长曲线，见图 3。结果显示与对照组相比，CTL1 治疗组及 CTL2 治疗组移植瘤生长均受到不同程度抑制（P0
12、.05，P0.01） 。在两治疗组中，CTL2 治疗组移植瘤生长受到抑制更明显（P0.05） 。3 讨论7鉴于 DC 是免疫系统中一类最重要的抗原提呈细胞（APC） ，在启动 T 细胞免疫应答和 T 细胞依赖性应答中起关键作用，近年来对DC 的临床研究愈来愈令人瞩目 24。我们观察到人外周血 PBMNC 经移弃大部分 T 细胞后，再于RPMI1640 完全培养液中继续培养 24h 获取贴壁单核细胞CD14+ ，经细胞因子联合刺激培养获取的 DC 群变为 CD14并诱导分化为两类 DC 亚群，借助于透射电镜观察到，从 A、B 两组人外周血富集的 DC 群（尤其是 B 组 DC 群）中相当一部分
13、DC 的胞膜和胞浆近膜侧有许多清晰可见的溶酶体，显示 DC 具有饱饮活性，这可能提示 B 组 DC 群抗肿瘤的能力更强。单核 巨噬细胞和 DC具有高度的派生、表型、功能和分子可塑性，它们源自骨髓中共同的多能造血祖细胞5。有文献报道，由 CD34+细胞分化而来的DC（CD34+ progenitor cellderived DC，PCDC) 和由单核细胞衍生来的 DC(monocytederived DC，MoDC) 的功能性质所有不同， PCDC 可能比 MoDC 更适合用于肿瘤的免疫治疗 6。两类 DC 亚群，经 SMMC7721 细胞的可溶性抗原刺激后在体外诱导自体 T 淋巴细胞分别产生
14、CTL，两类 DC 亚群诱导的 CTL 对SMMC7721 细胞与 hepG2 细胞杀伤率差异性说明两类 DC 亚群诱导的 CTL 存在差异性和较高的特异性，进一步在荷瘤裸鼠模型进8行治疗性研究发现，B 组 DC 群诱导的 CTL 具有显著的抑瘤效应，与 A 组 DC 群治疗组诱导的 CTL 及对照组相比，差异具有显著性。体内实验产生抗肿瘤效应结果与体外实验的结果一致。本研究结果为我们进一步从人外周血分离富集 DC，采用抗原特异性 DCs 激发肿瘤抗原特异性自体 T 细胞并输注给肿瘤患者的过继免疫疗法提供了新思路，值得进一步研究7，8 。【参考文献】 1 王坤，吴一龙，周清，等. 临床级树突状
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