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1、1比格犬注射重组腺病毒 AdHGF后血清中抗腺病毒抗体及中和抗体的检测作者：哈小琴,赵治华, 吕同德,劳妙芬,吴丹莉 ,吴祖泽 【摘要 】 目的： 观察 Beagle 犬重复给予 AdHGF后血清中抗腺病毒抗体及抗肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）抗体的出现时间及消失规律. 方法： 将 24 只比格犬随机分为四组：正常对照组、手术对照组、AdHGF 小剂量组(2.4107 pfu/ kg)和 AdHGF大剂量组(2.4108 pfu/ kg). AdHGF各组犬给予不同剂量 AdHGF共 14 次. 在给药 2 次后分别利用病毒中和反应和 ELISA
2、方法检测血清中抗腺病毒抗体和抗 HGF 抗体. 结果： 手术组、正常对照组及实验组动物于给药前及给药 3 次时血清细胞均未出现明显中和反应. 给药 4 次后各剂量组动物血清均对腺病毒有不同程度中和作用，至停药后 12 wk 抗体水平很低或已不存在. 各时间点血清样品中未检测到抗 HGF 抗体. 结论： 犬肌注AdHGF 4 次后动物血清中检测到了抗腺病毒抗体，停药 4 wk 后抗体水平有不同程度下降，直至 12 wk 后血清中腺病毒抗体基本消失. 【关键词】 AdHGF；抗腺病毒抗体；中和抗体；血清20 引言基因治疗可能成为一些重大疾病如恶性肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、传染病包括艾滋病等的
3、有效治疗手段1. 而基因治疗用于临床所面临的最大问题就是如何将治疗基因有效地转移至靶组织，其中载体的选择十分重要. 腺病毒载体是基因治疗中广为应用的一种载体，目前已成功地应用于多项基因治疗的临床试验中2. 我们对重组腺病毒 AdHGF长期毒性试验中比格犬血清中抗腺病毒抗体进行检测分析，将对 AdHGF的实际应用具有指导意义.1 材料和方法1.1 材料 Beagle 犬 24 只， 57 mo 龄，体质量 67.5 kg，雌雄各半（军事医学科学院动物实验中心）. AdHGF(携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒)，AdGFP( 携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒)和 293 细胞（以腺病毒 E1
4、基因转化的人胚肾细胞系）均由军事医学科学院二所三室提供. 鼠抗人 HGF mAb（R&D） ，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc ),重组人 HGF 蛋白纯品（R&D）, DMEM(Gibco), 小牛血清（天津血研所）, 猴抗血3清（军事医学科学院五所昭衍新药研究中心） ，洁净工作台（北京半导体设备一厂） ，CO2 培养箱（Sanyo ）, IX70 倒置荧光显微镜（Olympus ）,PM30 自动照相系统（Olympus）.1.2 方法1.2.1 动物分组设正常对照组、手术对照组、AdHGF 小剂量组(2.41
5、07 pfu/ kg, 拟临床用量 3.4 倍)和大剂量组(2.4108 pfu/ kg, 拟临床用量 34 倍) ，每组 6 只.1.2.2 给药途径采用心肌注射和臀部肌肉注射相结合,首次心肌注射，其余 13 次为肌肉注射给药. 给药期限为 7 wk, 2 次/wk，给药次数合计 14 次. 给药 2 次后利用病毒中和反应每周检测 1 次犬血清中抗腺病毒抗体，直到停止注射后 3 mo.1.2.3 犬血清中抗腺病毒抗体测定利用病毒中和反应方法，即病毒与抗血清中和后，将其感染细胞，细胞不产生病变为抗腺病毒抗体阳性，反之细胞出现病变为抗腺病毒抗体阴性，并观察绿色荧光是否出现. 将 293 细胞接种
6、于 96 孔细胞培养板上， 5104 个/ 孔. 次日感染病毒（AdGFP ）与血清的混合液: 取 20 L犬血清加8 u 的青霉素，再加 5106 pfu 病毒, 相当于 100 MOI (multiplicity of infection, 感染强度)，混匀后 37 水浴 30 min. 4吸弃原培养液，加入上述混合液，每个样品双份，每孔加入 200 L，以小牛血清加病毒液作阴性对照, 猴抗血清为阳性对照，置37，50 mL/L CO2 的培养箱继续孵育. 24，36，48 h 观察荧光及 CPE(细胞病变效应).1.2.4 犬血清中中和抗体测定用 ELISA 方法测定血清中抗HGF 抗体
7、水平. 收集稳定分泌表达 HGF 的 CHO 细胞的培养上清作为抗原，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG 为二抗，新鲜配制的OPD 为底物显色液，测 A490 nm 值. 同时用抗 HGF mAb 作一标准曲线，以计算抗体的滴度.2 结果2.1 血清抗腺病毒抗体检测共 12 次采血，受试动物 212 只次，手术对照组及正常对照动物血清均出现明显 CPE 及强荧光(图 1).给药前及给药 2 次后 24 h 的血清也出现明显的阳性结果. 给药 4次后大剂量组 5 只动物血清均对腺病毒有中和作用(图 2A)，小剂量组 3 只动物也已检测到抗体 . 给药 6 次后，动物全部检测到高滴度抗体(图 2B
8、). 停药后 4 wk，抗体水平下降，直至停药 12 wk，大剂量和小剂量组动物抗体水平基本都已下降为“” ，分别出现明显CPE 及荧光. 同时观察到动物性别及给药剂量大小无差异.5A: 293 细胞表达强绿色荧光蛋白； B: 与(A)同视野 293 细胞出现明显 CPE.图 1 荧光显微镜观察示强荧光和明显 CPE100（略）A: 少量 293 细胞表达绿色荧光蛋白； B: 极少量 293 细胞表达绿色荧光蛋白.图 2 荧光显微镜观察示弱荧光100 （略）2.2 血清中抗 HGF 抗体的检测结果各时间点血清样品中未检测到抗 HGF 抗体，表明局部注射重组腺病毒 AdHGF后，犬血清中可能不产
9、生抗 HGF 抗体.3 讨论腺病毒载体是继逆转录病毒载体之后在基因治疗中广为应用的一种基因转移载体，可感染种类相当广泛的有丝分裂后细胞，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞、肺细胞、脑细胞和心肌细胞. 该病毒有以下优点3-6： 对人类安全，无致畸、致病及致癌性； 对分裂细胞及癌细胞株的转染效率达到90%100%； 腺病毒感染细胞时 DNA 不整合到宿主细胞染色体中； 腺病毒容易制备、纯化和浓缩，可达到较高滴度； 腺6病毒载体插入外原基因的容量较大，所以目前国外多用复制缺陷的腺病毒为载体介导 p53 基因转移. p53 基因治疗的研究虽然取得了一定的成绩，也存在不少问题. 最突出的
10、问题为抗体的产生,病毒载体均可引起抗体产生. 腺病毒能引发强烈的免疫反应，在第一次感染后两 wk 内恒河猴血浆中的抗腺病毒体滴度升高7. 由于抗体的产生，腺病毒为载体的基因导入难以反复应用. 近年来，人们对这种载体作了大量改造工作，细胞毒性和免疫原性都有所减弱3.由于比格犬的长期多次开胸心肌注射有困难，故本实验给药方法为：心肌注射和臀部肌肉注射相结合的给药方法. 一方面考虑到长毒的用药途径与临床用药的一致性；另一方面，考虑到犬心肌注射开胸腔造成的创伤太大，若反复多次开胸给药，创伤所引起的反应可能会干扰毒性反应的观察指标，故采用首次心肌注射，其余13 次为肌肉注射给药. 本研究结果显示 ： 手术
11、对照、正常对照组，细胞出现明显 CPE，GFP 为阳性，而接受多次 AdHGF注射的动物，细胞不出现 CPE，GFP 阴性，说明多次注射 AdHGF后出现抗腺病毒抗体. 停药 7 wk 后出现不完全中和反应，抗体水平开始下降. 停药 12 wk 抗体逐渐消失，分别出现明显 CPE 及荧光，两项检测指标互补，实验结果可信. 比格犬血清对 293 细胞毒性较大，有时影响观察，必须事先 56灭活 . 受试动物抗体滴度不低于军事医学科学院五所昭衍新药研究中心提供的猴抗 5 型腺病毒抗血清效价 1800. 各时间点血清样品中未检测到抗 HGF 抗体，7表明局部注射重组腺病毒 AdHGF后，犬血清中可能不
12、产生抗HGF 抗体，可能因为 HGF 是一生理性生长因子，局部注射AdHGF后 HGF 的表达仅在局部，而且 HGF 蛋白的半衰期很短.【参考文献】1 任斌 ，译. 基因治疗学M. 西安：世界图书出版公司. 2000:89-270. 2Edelstein ML,Abedi MR,Wixon,J, et al. Gene therapy clinical trials worldwide 1989-2004an overviewJ . J Gene Med,2004,6:597-602.3Shayakhmetov DM, Gaggar A, Ni S, et al. Adenovirus bin
13、ding to blood factors results in liver cell infection and hepatotoxicityJ . J Virol, 2005,79 (12):7478-7491.4Pandori M, Hobson D, Sano T. Adenovirusmicrobead conjugates possess enhanced infectivity: a new strategy for localized gene deliveryJ . Virology, 2002,299(2):204-212.85Nasz I, Adam E. Recombi
14、nant adenovirus vectors for gene therapy and clinical trialsJ. Acta Microbiol Immunol Hung, 2001,48(34):323-348.6 Adam E, Nasz I. Adenovirus vectors and their clinical application in gene therapyJ. Orv Hetil, 2001,142(38):2061-2070.7 Zabner J, Petersen DM, Puga AP, et al. Safety and efficacy of repetitive adenovirusmediated transfer of CFTR cDNA to airway epithelia of primates and cotton rats J. Nat Genet ,1994,6:75-83.
