《毒胡萝卜素诱导K562细胞凋亡及其机制的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《毒胡萝卜素诱导K562细胞凋亡及其机制的实验研究（18页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1毒胡萝卜素诱导 K562 细胞凋亡及其机制的实验研究作者：冯献启，游泳，肖娟，邹萍【摘要 】 本研究旨在探讨毒胡萝卜素对 K562 细胞的凋亡诱导作用及其可能机制。采用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态变化，annexin-FITC/PI 双染法 FCM 检测凋亡率的变化， Ca2+荧光指示剂 Fura-2/AM 法荧光分光光度计测定细胞内 Ca2+浓度（Ca2+i）的改变，Rh123 单染法 FCM 检测线粒体 m 的变化，Western blot 检测 caspase-3，-7，-9，-12、细胞色素 C和 GRP78 蛋白的改变。结果显示： 4 mol/L 毒胡萝卜素作用K562 细胞 48
2、 小时后，荧光显微镜观察到细胞呈典型的凋亡形态变化，早期凋亡细胞核染色质呈固缩状、圆珠状或斑块状；晚期凋亡细胞核染色质呈固缩状或斑块状。1、2 、4、8 mol/L 毒胡萝卜素作用 K562 细胞 24 和 48 小时后细胞凋亡率分别为7.51、11.65、23.22、30.56和12.85、20.27、31.51、44.16，在一定范围内呈剂量和时间依赖性，与对照组比较，均有统计学意义（P0.05） 。毒胡萝卜素诱导 K562 细胞Ca2+ i 升高以及线粒体 m 下降，并均呈一定的浓度依赖性，与对照组比较，均有统计学意义2（P0.05） 。Western blot 检测显示，毒胡萝卜素诱导
3、 K562 细胞 caspase-3，-7，-9，-12 剪切活化、细胞色素 C 释放、GRP78表达上调。结论:毒胡萝卜素可诱导 K562 细胞发生内质网应激反应性凋亡，内质网是细胞内诱导凋亡的一个重要新场所；caspase-3，-7 ，-9，-12 剪切和活化、线粒体 m 破坏和细胞色素 C 释放是毒胡萝卜素诱导 K562 细胞凋亡的重要机制之一，线粒体参与内质网应激反应性凋亡途径并发挥重要作用。 【关键词】 毒胡萝卜素Thapsigargin-induced apoptosis of K562 cells and its mechanismAbstract The aim was to
4、study the apoptotic induction effect of thapsigargin on leukemia cell line K562 and its possible mechanism. After the treatment of leukemia cell line K562 by thapsigargin，morphological change of apoptotic cells was investigated by AO/EB fluorescent staining under fluorescent microscope；apoptosis rat
5、e was determined with annexin-FITC/PI double staining by flow cytometry；intracellular calcium concentrations (Ca2+i) were measured by fluorescence spectrophotometer with 3calcium sensitive fluorescence indicator Fura-2/AM；mitochondrial transmembrance potentials (m) was detected on flow cytometry thr
6、ough staining of Rhodamine (Rh123)；the changes of caspase-3，-7，-9，-12、cytochrome C、GRP78 proteins were detected by Western blot. The results showed that K562 cells cultured in 4 mol/L thapsigargin for 48 hours exhibited typical morphological changes of apoptotic cells under fluorescent microscope，in
7、cluding shrinkage of cell，condensation of chromatin，breakage of nuclear，formation of apoptotic bodies，fluorescence of yellow green and pellet observed in early apoptoyic cells and hyacinth fluorescence of chromatin showed in late apoptotic cells. 24 and 48 hours after exposure to 1，2，4 ，8 mol/L thap
8、sigargin，the apoptotic rates of K562 were respectively 7.51%，11.65%，23.22%，30.56% and 12.85%，20.27%，31.51%，44.16%，in dose- dependent manner，and were statistically significant when compared with the controls (P0.05). The apoptotic rate of K562 was dose- and time-dependent in experiment range. The enh
9、ancement of Ca2+i and the decrease of the m in K562 cells were induced by thapsigargin and were dose-4dependent in experiment range，compared with control，P0.05. Western blot results indicated that cleavage and activation of caspase-3， -7，-9，-12，releasing of cytochrome C from mitochondria，upregulatio
10、n of GRP78 expression at the endoplasmic reticulum were induced in K562 cells after 24 hours exposure of 4 mol/L thapsigargin. It is concluded that thapsigargin induces endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in K562 cells. Endoplasmic reticulum is a novel important initiatory site of apoptos
11、is in cells；the cleavage and activation of caspase-3，-7， -9，-12 play very important role in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis of K562 cells and is one of the important mechanisms for thapsigargin-induced apoptosis. Thapsigargin-induced apoptosis in K562 cells isassociated closely with t
12、he disruption of the m and the release of cytochrome C from mitochondria，mitochondria participates in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in K562 cells.Key words thapsigargin；leukemia cell line；K562 5cell；apoptosis；endoplasmic reticulum；caspase化疗是目前治疗白血病的主要手段。虽然造血干细胞移植术是治疗白血病的理想方法，但是大部分患者
13、由于无合适供者或不适合移植最终因化疗无效而死亡。白血病化疗无效的主要原因是白血病细胞突变及原发或继发耐药。因此，临床上亟需寻找针对白血病细胞内不同靶位点的新疗法。最近研究发现，内质网可能是细胞内诱导凋亡的一个新场所，即内质网应激反应性凋亡途径，它不同于经典的凋亡途径：死亡受体途径和线粒体途径1，2 。作为一种新的凋亡通路，其确切机制尚未完全清楚。本研究以白血病细胞系K562 细胞为研究对象，以内质网 Ca2+-ATP 酶抑制剂毒胡萝卜素（thapsigargin，TG）为内质网应激诱导剂，初步探讨 TG 对K562 细胞的凋亡诱导作用及其可能机制，为开辟白血病化疗新方案提供一定的实验和理论依据
14、。材料和方法试剂和细胞系细胞系 K562 细胞为本室常规培养；小牛血清、RPMI 1640培养液均购自 Gibco 公司；吖啶橙（AO ） 、溴化乙锭（EB）为Sigma 公司产品；兔抗人 caspase-3，-12，GRP78 多克隆抗体、 6鼠抗人 caspase-7，-9，细胞色素 C 单克隆抗体、毒胡萝卜素、Ca2+荧光指示剂 Fura-2/AM、化学发光剂LumiGLO、annexin-FITC 试剂盒均购自晶美生物工程有限公司；考马斯亮兰 CBBG250 蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；荧光染料 Rh123、Western blot 常规试剂均购自北京中山生物技术有限公司
15、。细胞培养K562 细胞于含 10小牛血清、青霉素、链霉素各 100 U/ml 的 RPMI 1640 培养液中，37、5 CO2、饱和湿度培养箱常规传代培养。实验分组：对照组（只加二甲亚砜）和试验组（加不同浓度的毒胡萝卜素） ，每次实验重复 3 次。荧光显微镜观察取对照组和 4 mol/L 毒胡萝卜素作用 48 小时的试验组K562 细胞，制备细胞悬液，浓度为 1107/ml；取 95 l 细胞悬液，对对照组和试验组各加 2 l 吖啶橙（100 g/ml）和溴化乙锭（100 g/ml）贮存液，染色 10 分钟；滴加 1 滴染色的细胞悬液于洁净载玻片上，直接用盖玻片封片；荧光显微镜下观察凋亡细
16、胞形态并照相。7细胞凋亡的 FCM 检测采用 annexin-FITC/PI 双染法 FCM 检测。方法参照试剂盒说明书进行：1、2、4、8 mol/L 的毒胡萝卜素作用 K562 细胞24 和 48 小时后，分别收集对照组和试验组细胞，PBS 充分洗涤细胞，取总数约为(5-12.5)104/ml；用 250 l 结合缓冲液（用dH2O 14 稀释）重悬细胞并使其浓度为(2-5)105/ml ；取 195 l 的细胞悬液加入 5 l annexin/FITC，混匀后于室温避光孵育10 分钟；用 190 l 的结合缓冲液洗细胞 1 次，用 190 l 的结合缓冲液重悬细胞，加入 10 l 20 g/ml 的碘化丙锭溶液（终浓度为 1 g/ml） ；室温避光孵育 30 分钟，上 FCM 分析。细胞内 Ca2+浓度（Ca2+ i）的测定取对数生长期 K562 细胞，台盼蓝拒染
