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1、1正己烷致大鼠脂质过氧化及肝细胞 DNA 损伤的实验研究作者：齐宝宁，易建华，唐国慧，苗江丽，郭剑锋 【摘要 】 目的 研究正己烷(nhexane) 对大鼠的脂质过氧化作用和肝细胞 DNA 损伤的影响。方法 40 只雄性 SD 大鼠随机分成 5 组，即阴性对照组、75、150、300mg/kg 染毒组和阳性对照组，每组8 只。经腹腔注射染毒 4 周后，检测肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx) 的活力，血清还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛 (MDA)的含量；用彗星试验技术(SCGE)检测大鼠肝细胞 DNA 的损伤。 结果 大鼠体重随染毒时间而增加，阴性对照组增加最
2、快；随染毒剂量增加，肝组织匀浆中 SOD、GSHPx 活力、血清 GSH 含量明显降低，而血清 MDA 含量增大，组间比较有显著性差异(P0.05 或 P0.01)；肝细胞 SCGE 检测彗星尾长、尾 DNA(%)、尾矩、Olive 尾矩均增大，组间比较有显著性差异(P0.01)，尾矩值与染毒剂量作相关分析，相关系数 r 为0.981，呈正相关(P0.05)。 结论 正己烷可引起或增强机体氧自由基反应，导致脂质过氧化损伤和肝细胞 DNA 损伤。 【关键词】 正己烷；脂质过氧化； DNA 损伤；单细胞凝胶电泳技术2正己烷 (nhexane，CAS:110543) 属于直链饱和脂肪烃类，化学式为
3、C6H14，分子式为 CH3(CH2)4CH3，分子量 86.18；无色、高挥发性、易燃、常温下为微有异臭的液体；几乎不溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇12 。正己烷主要作为溶剂，广泛应用于制鞋、印刷、电子、粘胶配制、除污、干洗、植物油提取等行业3。有文献表明45 ：正己烷对神经细胞脂质有极化作用，导致膜扩张，通透性增强。动物吸入正己烷后，血中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、葡萄糖6 磷酸脱氢酶、酸性脱氢酶、尿苷酸化酶活性增高。这些内酶的外逸，间接说明正己烷具有膜损伤作用。沈齐英等6对大鼠静式急性吸入染毒，测定了MDA、GSH、SOD 和 GSHPx 等体现脂
4、质过氧化损伤的特异性指标。结果表明，正己烷的急性吸入导致机体氧化还原系统的变化，削弱了机体消除自由基的能力，发生了脂质过氧化损伤。正己烷引起机体氧化还原系统的改变，导致自由基水平升高，是否会进一步引起 DNA 损伤，目前尚未见有报道。故本实验用不同剂量的正己烷染毒大鼠，对其脂质过氧化和 DNA 损伤进行检测。旨在观察正己烷对大鼠的脂质过氧化及 DNA 损伤的影响，为探讨正己烷的遗传毒性和中毒机制提供理论依据和实验数据。1 材料与方法31.1 材料1.1.1 动物健康雄性 SpragueDawley(SD)大鼠 40 只，体重 180-220g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，适应性喂养一
5、周后进行染毒实验。1.1.2 试剂正己烷( 国产分析纯) ，环磷酰胺(上海华联制药有限公司) ，Triton X100(Gibco 公司，美国) ，戊巴比妥钠、低熔点琼脂糖(low melting agarose gel, LMA)、正常熔点琼脂糖(normal melting agarose gel, NMA)、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)、乙二胺四乙酸二钠盐(Na2ethylenediamine, Na2EDTA)、溴化乙锭(ethidium bromide, EB)均为美国 Sigma 公司产品。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase
6、, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSHPx)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone, GSH)测试盒均为南京建成生物工程研究所产品。1.1.3 仪器4DYY水平电泳槽 ，DYY 33A 电泳仪 ，NIKON 荧光显微镜型及 NIKON AFXA 型拍摄装置 ，恒温水浴箱，DY89 型电动玻璃组织匀浆器，CASP 图像分析软件。1.2 方法1.2.1 动物分组及染毒将 40 只雄性 SD 大鼠随机分为 5 组，即阴性对照组、低剂量染毒组、中剂量染毒组、高剂量染毒
7、组和阳性对照组(环磷酰胺)，每组 8 只，采用腹腔注射染毒 5。阴性对照组仅用注射针穿刺腹腔，不注射任何试剂，低、中、高暴露组染毒剂量分别为75、150、300mg/kg ，阳性对照组为 50mg/kg，每日上午染毒 1次，每周 5d，连续 4 周。染毒过程中，所有大鼠均自由饮水、进食。每 3d 称体重 1 次，调整染毒剂量，记录大鼠的一般状况和体重变化。1.2.2 单细胞凝胶电泳试验参照 Singh 等7方法略加改进。主要步骤有： 单细胞悬液的制备。染毒结束后，用质量浓度为 20g/L(2%)的戊巴比妥钠麻醉5大鼠，剖开腹部，立即取出一 5nm5nm 肝脏组织，装于盛有 4磷酸盐缓冲液(ph
8、osphate buffered solution, PBS)的小烧杯中，洗去血液，然后加入 RPMI 1640 培养液，用眼科剪剪碎，制成单细胞悬液。 胶板的制备。将预热 50 100L 质量分数为 0.6%的 NMA 滴加到无水乙醇浸泡的磨砂载玻片上，迅速盖上干净的盖玻片，室温下静置 10min 使其凝固，为第 1 层凝胶；取 10L 大鼠肝细胞悬液加入 37 80L 质量分数为 0.5%的 LMA 中，混匀后迅速滴加到第 1 层胶上，立即盖上干净的载玻片，室温下静置 10min使其凝固，为第 2 层胶；最后在第 2 层胶上滴加预热 37 的质量分数为 0.5%的 LMA,盖上盖玻片，室温
9、下使其凝固。细胞裂解。移去盖玻片，将载玻片浸入新配制的细胞裂解液(2.5mol/L NaCl，100nmol/L Na2EDTA，10nmol/L Tris，10g/L 肌氨酸钠，临用前加体积分数为 1%的 TritonX100，10% DMSO，pH 10)中，于 4冰箱中裂解 1h。碱解旋。从裂解液中取出载玻片，用PBS 冲洗 2 次，洗去过多的盐，晾干后置于水平电泳槽中，将新配制的电泳缓冲液(1mmol/L Na2EDTA，300mmol/L NaOH，pH=13，4预冷)倒入电泳槽中，液面约覆过胶面0.25cm 左右，避光静置 25min，以便使 DNA 在碱性条件下解螺旋成单链 DN
10、A，使 DNA 断片在电泳场中易于迁移。电泳。电压为 25V，电流 300mA，4 环境下电泳 20min。中和与染色。电泳结束后，取出载玻片，吸水纸吸干电泳缓冲液，用 0.4mol/L 的TrisHCl(pH7.5) 中和 15min，然后每片载玻片上滴加 30mg/L6的 EB 水溶液 50L，盖上盖玻片，染色 20min，即可观察。阅片。24h 内在荧光显微镜下观察，数码相机拍摄照片，每张玻片随机拍摄 30 个细胞，在电脑上用 CASP 彗星软件分析。1.2.3 血清脂质过氧化指标的测定染毒结束后，用质量浓度为 20g/L(2%)的戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹部开 U 型口，暴露心脏，从心尖抽
11、取 5mL 全血，置于试管中，37水浴 2h，离心(3000r/min，10min)，分离血清检测 GSH和 MDA 含量。MDA 含量测定按硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)比色法，GSH 含量测定按 Haffeman 微量法。1.2.4 组织匀浆抗氧化酶活力测定立即取新鲜肝脏组织块(0.2-1g) ，除去血液，滤纸拭干，称重，加入 9 倍重量的冷生理盐水，用组织匀浆机制成 10%匀浆液，检测 SOD 和 GSHPx 活力。SOD 活力测定按邻苯三酚自氧化法，GSHPx 活力测定按二硫代二硝基苯甲酸(dithiobisnitrobenzoic acid, DTN
12、B)直接法。1.3 统计学处理测定值以均数标准差(s) 表示，采用 SPSS11.5 软件对数据7进行分析，多组均数之间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组之间的多重比较分别采用 Dunnettt 检验和 SNKq 检验。2 结 果2.1 大鼠体重的变化实验期间，各组体重均随时间而增加，对照组体重增加最快，低剂量组与对照组比较无明显差异。在 0、 3、6、12 、21、28d 时分别作方差分析，从第 6 天开始，组间有显著性差异 (P0.05)；各实验组与阴性对照组作 Dunnettt 检验，中、高剂量组与对照组之间有显著性差异(P0.05 或 P0.01)；各实验组之间再作SNKq
13、检验，低剂量组和高剂量组有显著性差异(P0.05，表 1)。表 1 各剂量组大鼠在不同时间的体重变化（略）2.2 正己烷对大鼠血清 MDA 和 GSH 含量的影响血清中 MDA 含量随染毒剂量增加而增大，GSH 含量则随染毒剂量增加而减少，作方差分析，组间有显著性差异(P0.05)；各实验组与阴性对照组作 Dunnettt 检验，中、高剂量组与对照组之间有显著性差异(P0.05 或 P0.01)；实验组之间再做SNKq 检验，低剂量组和高剂量组有显著性差异(P0.05，表 2)。8表 2 各组大鼠血清中 MDA、GSH 含量的变化（略）2.3 正己烷对大鼠肝组织匀浆 SOD 和 GSHPx 活
14、力的影响肝组织匀浆中 GSHPx 、SOD 活力随染毒剂量增加而减小，作方差分析，组间有显著性差异(P0.05)；各实验组与阴性对照组做 Dunnettt 检验，高剂量组与对照组之间有显著性差异(P0.01)；实验组之间再作 SNKq 检验，低剂量组和高剂量组有显著性差异(P0.05 ，表 3)。表 3 各剂量组大鼠肝组织匀浆 SOD、GSHPx 的活力（略）2.4 正己烷对大鼠肝细胞 DNA 损伤的影响随着染毒剂量的增加，尾长、尾 DNA(%)、尾矩、Olive 尾矩值均增大。各实验组与对照组做 Dunnettt 检验。结果显示，阳性对照组与阴性对照组比较，尾长、尾 DNA(%)、尾矩、Ol
15、ive 尾矩均有显著性差异(P0.01)；中、高剂量组与阴性对照组比较，尾长、尾 DNA(%)、尾矩、Olive 尾矩有显著性差异 (P0.01)；低剂量组与阴性对照组比较，无显著性差异。实验组之间再做SNKq 检验，低剂量组和高剂量组有显著性差异(P0.05，表 4)。92.5 大鼠肝细胞 SCGE 结果的相关分析 以染毒剂量为横坐标，尾矩值为纵坐标做散点图，观察随正己烷染毒剂量的增加对大鼠肝细胞 DNA 损伤的剂量 效应关系。做相关分析，相关系数 r 为 0.981，呈正相关(P0.05)。表 4 各组大鼠肝细胞单细胞凝胶电泳的结果（略）3 讨 论机体代谢及损伤过程中可产生超氧自由基，若不
16、及时消除，就会对自身造成氧化胁迫，引起脂质过氧化，对细胞膜甚至整个细胞造成损伤。但在正常的生理条件下机体同时存在抗氧化系统，能清除自由基，阻断脂质过氧化，保护细胞的正常生理功能，这是需氧生物抵御过氧化损伤的主要机制8。SOD 和 GSHPx 是体内两种十分重要的抗氧化酶，是机体抗氧化防御系统的重要成员。GSH是细胞中最重要的非酶性小分子抗氧化剂之一。 MDA 是自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸而引发的脂质过氧化作用的最终分解产物，其含量水平可反映机体内细胞脂质过氧化的程度。本次实验通过正己烷对大鼠亚急性染毒，观察正己烷对大鼠脂质过氧化的作用。通过检测大鼠的肝脏组织匀浆中 SOD、GSHPx 酶的活性和血清中 GSH 和 MDA 含量来反映脂质过氧化程度。结果表明，各正己烷染毒组与对照组相比较，抗氧
