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1、FCM在肿瘤学研究中的应用 Medline Publications citing Flow cytometry 0 1000 2000 3000 4000 5000 1960年 1965年 1970年 1975年 1980年 1985年 1990年 1995年 2000年 Year Publications The use of flow in research has boomed since the mid 1980s 应用范围 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 肿瘤病理的FCM分析 肿瘤分子生物标志物的FCM分析 细胞增殖和凋亡的FCM分析 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 理论依据 G0
2、期 不参与增殖周期循环的一群细胞 即为静止期细胞 其细胞DNA含 量为较恒定的2C值 一 细胞周期 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 理论依据 G1期 细胞具有增殖活性 参与细胞周 期循环的一群细胞G1期细胞值与 G0 期细胞DNA值相同 均为二 倍体DNA含量 一 细胞周期 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 理论依据 S期 细胞DNA含量值逐渐增加 从 2C 值 4C值直到细胞DNA倍增结束 一 细胞周期 G2 M期 在M期分裂为两个子细胞之 前 G2和M期细胞的DNA 含量均为恒定的4C值 即 为四倍体细胞群 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 理论依据 一 细胞周期 实体肿瘤DNA倍体的FCM分
3、析 理论依据 二 荧光染料与细胞DNA的关系 荧光染料可与细胞DNA特异性结合 并有一定的量效关系 1 DNA含量的多少与荧光染料的结合 成正比 2 荧光强度与DNA吸收荧光分子多少成 正比 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 理论依据 二 荧光染料与细胞DNA的关系 3 荧光脉冲与组方图的通道值成正比 因此 FCM DNA定量分析一个细 胞群时 可将二倍DNA含量分布组 方图分为三部分 即G0 G1 S G2 M G0 G1和G2 M细胞峰DNA的分 布均成正态分布 S期可以认为是一 个加宽的正态分布 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 G1 S phase G2 M G1 12 1 DNA con
4、tent The Cell Cycle G0 1 G2 M S 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 DNA含量的计算方法 1 FCM定量分析一个细胞群 其 DNA含量值是以DNA指数 DNA index DI 表示其相对DNA含量的 实验样品细胞G0 1峰的均道值 DI 正常细胞G0 1峰的均道值 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 DNA含量的计算方法 2 一个正常的二倍体细胞峰 其 G0 G1期细胞DNA含量为2C DI值 为1 0 G2 M期细胞DNA含量为 4C DI值为2 0 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 DNA含量的计算方法 例如 如果一个未知DNA含量的细胞群 G0 G1期细胞峰的均道
5、值在60道 正 常二倍体标准细胞G0 G1峰均道值也 在60道 那么 这个未知DNA含量的 细胞群DI 1 0 如果一个未知DNA含 量的细胞群G0 Gl峰均道值在90道 DI 1 50 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 DNA倍体的判定标准 DNA倍体的判定是根据所测细胞群 DNA含量分布组方图G0 G1峰的DNA 相对含量值 即DNA指数值进行判定 的 从理论上讲 二倍体的DI值应为 1 0 四倍体的DI值应为2 0 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 DNA倍体的判定标准 以二倍体参考标准细胞G0 G1期细胞 DNA含量定为2C值 DI 1 0 基于标 准二倍体细胞的CV值在5 判定标 准即
6、DNA二倍体 2C士2CV值 DNA异倍体 2C士2CV值 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 DNA倍体的判定标准 即DI 1 0士0 1 0 9 1 10 为二倍体 DI 1 0士0 15 0 85 1 15 为近二倍体 DI 2 0士2CV 1 90 2 10 为四倍体 DI 2 10 多倍体 其余DI值均为非整倍体 在计算DNA异倍体时 把近二倍体 多倍体 四倍体 非整倍体划为异倍体 Heteroploidy 的范畴 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体的组方图类型 自FCM被引入肿瘤研究以来 已经 对各类型新鲜肿瘤组织和石蜡包埋肿瘤 组织进行DNA倍体的定量分析 为研究 肿
7、瘤DNA含量的分布状态 提供了非常 直观的参考信息 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体的组方图类型 DNA组方图常见的类型以单一DNA 干系多见 说明肿瘤的发生多以单一细 胞克隆发生而来 我们对3050例恶性肿 瘤DNA倍体分析结果显示 单一DNA干 系的组方图占80 90 左右 双干系或多 干系的DNA组方图较少见 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体的组方图类型 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体的组方图类型 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体的组方图类型 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体的组方图类型 实体肿瘤
8、DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体的组方图类型 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体的组方图类型 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体的组方图类型 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 DNA含量检测结果报告 报告中至少应包含以下信息 1 DNA倍体 包括所有群体的DI 2 主要G1峰的CV 3 S期比例 4 必要的简单评价 如细胞数的不足 碎片较多 CV太高等 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用 膀胱癌 肾细胞癌 前列腺癌 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用 膀胱癌 FCM与膀胱癌的
9、诊断 FCM在膀胱癌术后随访的作用 FCM在判定膀胱癌的恶性程度中的作用 FCM在预测膀胱癌的复发和预后中的作用 FCM在指导膀胱癌的治疗中的作用 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用 膀胱癌 膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿 瘤 其癌细胞的分裂增殖能力异常活跃 细胞的DNA含量多有不同程度的增高 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用 膀胱癌 标本来源 经膀胱镜或尿管冲洗膀胱脱所获标本 含细胞数较多 可提供良好的FCM 检测标本 但需受器械 检查之苦 尤其在随访中需多次留取标本 病人 往往难于接受 所以 唯新鲜尿标本 才
10、是真正的非侵入性检查方法 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用 膀胱癌 标本来源 应用尿液作FCM检测诊断膀胱癌是否 可获得满意结果尚有争议 White等曾报告86例膀脱肿瘤患者的尿 液和膀脱冲洗液作FCM检测 94 的 尿液标本和97 的膀脱冲洗液 得到了 满意的图形 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用 膀胱癌 标本来源 Pritchete等亦采 用新鲜尿与膀脱冲洗 液标本 发现两者在图形显示及肿瘤 检出率方面无明显差异 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用 膀胱癌 标本来源
11、本研究室曾对l01例膀脱肿瘤患者作 FCM检测 其中78例取300 500ml新鲜 尿液 23例取膀胱镜冲洗液 结 果 发 现 肿瘤检 出率分别 为 84 61 和 86 95 两组 数 据 经 统计学处理无 明显差异 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用 膀胱癌 标本来源 所以我们认为 新鲜尿标本适用于做 FCM标本 对标本细胞数少 图形不 满意者 可取膀脱冲洗液 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用 膀胱癌 膀胱冲洗液的收集方法 经膀脱镜或尿导管向膀脱内加压注 入生理盐水100 200ml 反 复抽吸3 4次 收集
12、的冲洗液应立即放入4 冰箱内冷藏 存放时间不应超过24 小时 若标本中含红细胞 可采用 加蒸馏水的低渗方法去除 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用 膀胱癌 膀胱冲洗液的收集方法 将收集到的尿液或膀脱冲洗液离心 后 PBS缓冲液冲洗2次 用细尼龙 网过滤以去除标本中杂质或 细胞团 块 离心弃上清液后用70 酒精固 定 放 10 冰箱贮存 最长贮 存时间可达 6个月 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用 膀胱癌 FCM与膀胱癌的诊断 FCM在膀胱癌术后随访的作用 FCM在判定膀胱癌的恶性程度中的作用 FCM在预测膀胱癌的
13、复发和预后中的作用 FCM在指导膀胱癌的治疗中的作用 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用 膀胱癌 FCM对膀胱癌的诊断 FCM DNA倍体分析诊断膀胱癌的标准 出现与正常二倍体峰明显分离的 异倍体或近二倍体波型 高倍体细胞比值 15 伴明显四 倍体细胞组成的波型 G0 l波型变异系数 9 凡出现上述标准之一者为FCM肿瘤阳性 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用 膀胱癌 FCM对膀胱癌的诊断 FCM DNA倍体分析诊断膀胱癌的标准 可疑 无明显异倍体细胞群 超二倍体 细胞群大于10 15 之间 阴性 二倍体分布 超二
14、倍体细胞2 10 多倍体 其余DI值均为非整倍体 在计算DNA异倍体时 把近二倍体 多倍体 四倍体 非整倍体划为异倍体 Heteroploidy 的范畴 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用 一 宫颈癌 有助于判定子宫颈癌预后 Jakobsen对DNA倍体与宫颈癌预后 的关系作了研究 结果提示 DI 值与生 存期显著相关 DI 大于 1 5治疗易失败 DI小于1 5存活率高 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用 一 宫颈癌 有助于判定子宫颈癌预后 吴爱茹等研究结果指出 在DI 1 5 的 60例中 仅8例死于癌 而DI 1
15、 5 的 18 例中则有5例死于癌 两组 有显著性差异 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用 一 宫颈癌 有助于判定子宫颈癌预后 FCM测定宫颈癌DNA含量显示 在 I 期子宫颈癌患者中 肿瘤细胞 DNA含量与其复发率 生存率密切相 关 但临床分期 肿瘤大小 病理 分类 淋巴转移与肿瘤细胞的DNA 含量无明显相关性 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用 一 宫颈癌 有助于判定子宫颈癌预后 Davis等对 56 例宫颈癌病人的 FCM 研究资料显示 异倍体与预后 无关 DI大于或小于1 5时治疗失败率 均等 实体肿瘤DNA倍
16、体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用 一 宫颈癌 有助于判定子宫颈癌预后 由于FCM测定标本来源不同 新 鲜活检标本与存档石蜡块不同 仪器 基础参数不同 光源不同等因素 所 得研究资料不太一致 尚待进一步研 究证实 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用 一 宫颈癌 二 子宫内膜癌 三 滋养叶细胞肿瘤 四 卵巢肿瘤 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用 二 子宫内膜癌 子宫内膜癌FCM DNA倍体分析 子宫内膜癌DNA倍体与临床分期 子宫内膜癌DNA倍体与组织分级 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用 二 子宫内膜癌的 DNA倍体分析 Atkin 和Hastin等用FCM分析57 例宫内膜癌病人 38例 73 是二倍体 14例 27 是非整倍体 DI值在 1 65 2 34 8例转移癌中5例 63 是 非整倍体 其中2例伴有腹水 在腹水 中的肿瘤细胞DI值和原发癌相一致 据此 他们认为 大多数宫体腺癌为 DNA二倍体 实体肿瘤DNA倍体的FCM分析 FCM DN
