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1、1核转录因子 B 与脑缺血再灌注损伤【关键词】 脑缺血NFkappa B and cerebral ischemia reperfusion 脑缺血再灌注损伤（CIRI）是由兴奋性（氨基酸）中毒、氧化应激、细胞内钙超载、炎症反应和细胞凋亡（AP ）等多种因素参与的病理过程1 。以往对 CIRI 机制的研究主要集中在氧化应激、兴奋性（氨基酸）中毒、细胞内钙超载等方面，近年来随着分子生物学的发展，发现 CIRI 与炎症反应和细胞凋亡也有着密切的关系。CIRI 中炎症细胞和炎症分子起了关键的作用，而可以调节多种炎症分子转录并能引起靶基因表达增加的核转录因子 B（NFB）起着重要的调控作用。同时 CI
2、RI 后细胞凋亡的发生又是一个由基因调节的细胞主动死亡过程，多种基因产物的主动表达在 CIRI 后细胞凋亡的发生过程中起保护或损伤作用；另外，NFB 作为前凋亡因子或抗凋亡因子以不同的组合形式与某些凋亡相关基因结合对 CIRI 又有着不同的影响。1 NFB 的生物学特性1.1 NFB 的结构特点 NFB 属于 Rel 蛋白家族，是由两种Rel 家族亚基：RelA（p65 ） 、RelB、cRel 和 NFB1（p50/p105） 、2NFB2（p52）中任意两种 NFBRel 蛋白亚单位构成的二聚体蛋白质，这些蛋白质均具有能与 DNA 结合的特性，又称 DNA 结合亚单位，其中发挥主要生理功能
3、的是 p50 与 p65 构成的二聚体蛋白质。当细胞处于静止状态时，NFB 与其抑制蛋白（Inhibitory Kappa B，IB）以非活性的配体结合存在于胞浆中而没有活性。1.2 NFB 的活化信号目前已发现多种因素可以诱导 NFB 的活化，主要包括：（1）外源性因素，包括紫外线、电离辐射、细胞毒性药物、微生物病原体及脂多糖等。 （2）内源性因素，包括细胞因子（肿瘤坏死因子 、IL1、淋巴毒素） 、炎症介质（血小板活化因子、白三烯、活性氧簇） 、生长因子（IL2、巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生的生长因子） 、免疫相关受体（CD3、CD18 、TCR等）及氧化应激等。中枢神经系统内的 NF
4、B 活化信号可分两类：第一类与上述活化信号类似；第二类为中枢神经系统特异的 NFB活化信号，如去极化、神经递质、神经生长因子及一些神经毒素刺激等。1.3 NFB 的激活途径 NFB 的激活途径主要为：（1）在大多数细胞中，NFB 二聚体与 IB 结合成三聚体。IB 覆盖于 NFB的核定位信号区（nuclear localization sequence，NLS） ，使之以无活性形式存在于胞浆中。细胞受到活化信号刺激后，由活化信号诱导激活的 IB 激酶（ IB Kinase，IK）引起 IB 蛋白第 32 和336 位丝氨酸的磷酸化，磷酸化的 IB 则由泛素蛋白在多个位点形成泛素化。最后，泛素化
5、的 IB 被 26S 蛋白酶水解降解，暴露出Rel 蛋白上的 NlS，这样就使 NFB 快速易位进入核内，与 DNA 特定序列结合，引起靶基因表达增加2 。 （ 2）在细胞核内水平，通过 p65 亚单位磷酸化引起 NFB 结构改变而调节 NFB 的转录活性。（3）NFB 的不典型激活途径，即 IK 独立的激活途径。1.4 NFB 的靶基因 NFB 诱导表达的靶基因有：（1）细胞因子，包括 TNFa、IL1、IL2、IL3 、IL6、IL8、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子；（2）粘附分子，包括血管细胞粘附分子 1（VCAM1） 、细胞间粘附分子 1（ICAM1） 、内皮细胞白细胞粘附分
6、子 1（IIAM1） ；（3）急性期蛋白，如 C 反应蛋白（CRP） 、血管紧张素；（4）受体，包括 MHC1、血小板激活因子受体、组织因子（TF） 、免疫球蛋白 轻链；（5 ）酶，如 COX2（可诱导环氧化酶 2） 、线粒体抗氧化酶；（ 6）趋化因子，如单核细胞趋化因子1、MIP、MCP；（7）参与细胞循环及凋亡的蛋白，包括cmyc、p53、Rb、TRAF1（TRADDTNFRassociated factor 1） 、TRAF2、凋亡抑制蛋白（tAPs 如 cIAP1 cIAP2） 、抗凋亡的 Bcl2 蛋白家族成员；（8）其他如可诱导一氧化氮合酶（NOS） 。对神经元有保护作用的有：tA
7、Ps、锰超氧化物歧化酶（MnSOD ）以及抗凋亡的 Bcl2 蛋白家族成员、粘附分子 ICAM1、NOS 等3 。41.5 NFB 的活化反馈调节 NFB 活化反馈调节有两种途径：（1）经细胞外的正反馈途径。 NFB 活化后可增强 TNF 和 IL1 的基因转录，使其产生和释放增多，进而再次激活 NFB；NFB 活化后还可使 IL6 和 IL8 产生和释放增多，导致最初的炎症信号进一步放大。 （2）经细胞内外的负反馈途径。在细胞内，NFB 活化后，在启动炎症介质基因转录的同时，IB 和 p105 的基因转录增强。这些抑制成分的增多有助于将 NFB 限制在细胞质中，使活化的NFB 活性下调，终止
8、细胞因子基因的转录，并限制急性炎症反应。此外，NFB 的活化，使 p50 同源二聚体生产增多，此种二聚体不能被 IB 有效结合，并缺乏转录激活区，易位至细胞核后，可与NFB 竞争性结合 B 序列，抑制 NFB 的活性。在细胞外，LPS、肿瘤坏死因子 （TNF）和 IL1 能刺激反向调节细胞因子 IL10 的产生，后者能阻断单核细胞中内毒素诱导的 NFB 的活化，抑制细胞因子的产生，限制急性炎症反应。正负反馈两种调节方式往往是同时进行的，至于 NFB 的活化状态则取决于何种调节占优势。2 NFB 和 CIRINFB 广泛存在于神经系统中，包括脑血管内皮细胞、神经细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和少
9、突胶质细胞。许多研究证实 CIRI 后有 NFB 表达的增加。Shen 等4应用大鼠全脑缺血再灌注（GCIRI）模型，缺血 30 min 于 612 h 后发现海马区 NFB 活性5较对照组增高 10 倍。Stephenson 等5发现在鼠大脑中动脉闭塞 2 h，再灌注后 2 h、6 h 和 12 h 脑缺血灶中 NFB 的活性进行性的增加，在缺血区皮质和纹状体中有 p50 和 p65 的表达。Williams 等6发现在再灌注后 24 h 缺血区大脑半球的神经元、神经胶质细胞、血管上皮细胞以及浸润的淋巴细胞中有很强的NFB 表达。Numi A 等7 在人脑卒中死亡后 23 h、28 h 和
10、38 h 尸检脑梗死灶中观察到 23 h 神经元胞浆中有很强的 NFB 活性表达，28 h 在细胞浆和细胞核中均检测到 NFB 的活性，38 h 只有细胞核中有中等量的 NFB 表达，证实了人类脑卒中后 12 d NFB 被激活并转移至神经元细胞核中。NFB 活性增高后对脑具有保护作用还是损伤作用目前仍存在异议。Crack PJ8等认为NFB 对脑具有保护作用还是损伤作用，主要取决于 NFB 产生部位、刺激物（活化信号） 、产生量和持续时间等。Clemens 等9用四管堵塞法（4vessel occlusion）造成鼠前脑缺血 30 min 再灌注 24 h 后发现 NFB 在前脑神经元中只有
11、短时间的活性增高，而72 h 在海马 CAI 区凋亡的神经元中仍有 NFB 活性表达，因此认为再灌注 24 h 后 NFB 可能诱导神经元中保护因子的产生，而再灌注72 h 海马区神经元 NFB 活性持续表达可诱导 CAI 神经元死亡蛋白的产生。Domanskajanik K 等10在研究海马不同区域神经元时发现，缺血 3 h NFB 活性增高，缺血 34 d，海马 CAI 区锥形细胞可见 DNA 断裂片断。Nurmi A 等7发现在持续性局灶性脑缺血中 NFB 能促进脑梗塞的形成。Stephenson11等用有神经6保护作用的抗氧化剂 LY341122 减低 NFB 的激活，使再灌注后DNA
12、 片段减少，梗死面积缩小；Wang YH 等12 发现黄衫素可通过其抗氧化作用，进而调节 NFB 的活化而减轻脑缺血再灌注损伤进而间接证明了 NFB 有神经损害作用。3 Bcl2、Bax 与 CIRICIRI中以神经元为主的细胞凋亡是其重要的病理生理过程。Bcl2基因家族是与细胞凋亡密切相关的基因，Bc12 和 Bax 分别是 Bc12家族中最具代表性的抑制凋亡蛋白和促进凋亡蛋白，二者的比值决定细胞的存活与凋亡。Bax 可与 Bcl2 蛋白形成异源二聚体或自身形成同源二聚体。当 Bax 蛋白受到凋亡刺激因素作用后，由胞质向线粒体外膜转位，与膜上电压依赖性离子通道结合，使之激活，形成同源二聚体，
13、并促使凋亡相关蛋白如细胞色素 C、caspase 酶原等从线粒体间隙释放入胞质中，执行凋亡程序。但随着 Bcl2 蛋白表达量的上升，Bcl2 可通过与 Bax 竞争性结合，使越来越多的 Bax 同源二聚体分开，与 Bc12 形成比 BaxBax 更稳定的 BaxBc12 异源二聚体， “中和”了 BaxBax 诱导凋亡的作用即封闭了 Bax 形成孔道的活性，阻止细胞色素 C 等穿过线粒体膜进入细胞质，避免凋亡启动复合物的形成，从而抑制细胞凋亡13 。通常，含少量 Bax 的细胞只需低水平的 Bc12 即可达到形成 BaxBc12 异源二聚体的严格化学剂量，从而终止凋亡的发生。因此，BaxBc1
14、2 异源二聚体形成的调7节是细胞凋亡调控中一个非常重要的环节。然而，也有研究提示，Bcl2 和 Bax 可独立地调节凋亡。因为，无 Bax 存在时，Bc12 仍可抑制凋亡；无 Bc12 存在时，Bax 也能够促进凋亡；而且， Bax 缺乏与 Bcl2 表达可产生协同效应影响凋亡。余涓等14用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）2 h/再灌注 24 h 模型，用 TTC染色观察脑梗死面积，TUNEL 法检测神经细胞凋亡，免疫组化法检测脑组织 Bcl2 和 Bax 蛋白表达，结果损伤侧脑组织出现明显的梗死灶，神经细胞凋亡率与 Bax 蛋白表达均明显升高， Bcl2/Bax 比值明显下降。王新高
15、等15也用同样的方法检测到大鼠颈动脉闭塞90 min/再灌注 48 h 模型梗死灶中 Bcl2/Bax 比值明显下降，并设想通过上调 Bcl2/Bax 来实现保护线粒体，对抗细胞凋亡，进而对抗CIRI。Xia CF 等16将人类组织激肽释放酶基因于鼠 MCAO 后移入鼠脑组织，经过观察发现在 CIRI 中激肽释放酶可通过调节 B2激肽受体，提高大脑 NO 及 Bcl2 的水平，降低过氧化物的产生和Bax 的水平来抑制细胞凋亡和炎症反应，促进血管和神经再生。Amemiya S17 等在用依达拉奉（自由基清除药）对抗 CIRI 的实验中发现该药是通过调节 Bcl2/Bax 依赖的抗凋亡机制来发挥神
16、经保护作用的。4 NFB 与 Bcl2、BaxBcl2基因家族包括8Bclxshort、Bcl2、Bclxlong、Bad 、Bak 、Bax 等，其中Bcl2、 Bclxlong 具有抑制凋亡的作用，Bclxshort、Bad、Bak、Bax 则有促进凋亡的作用。 Dixion 等18在研究中发现，Bclx 基因 5启动子区存在 NFB 结合一致性序列 NFB/CS4，而 Bcl2 家族其他成员在前 5 个调控区中也包含NFB/CS4 一致性序列。海马 CA1 区 NFB 于缺血 72 h 被持续激活，致使 Bclx 转录活性增强，因而 Bclxshort 增多，后者将促进细胞的凋亡过程。Qiu J 等19进一步研究认为，在全脑缺血后可形成 c
