《核糖体S6激酶对肝星状细胞内胶原表达的调控》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核糖体S6激酶对肝星状细胞内胶原表达的调控（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1核糖体 S6 激酶对肝星状细胞内胶原表达的调控作者：杨妙芳，许小兵，吴文娟，张晓华，朱人敏【摘要 】 目的： 探讨核糖体 S6 激酶（p90RSK ）调节肝星状细胞（HSC ） 型胶原表达的作用 . 方法： 将设计的 p90RSK 特异性siRNA 克隆至真核表达载体 pAVU6+27 中，构建 p90RSK 的RNA 干扰真核表达载体 pAVRSKi. 将构建的 pAVRSKi 通过脂质体瞬时转染 HSCT6，分别采用实时定量聚合酶链式反应和Western Blot 方法检测细胞的 p90RSK 和型胶原 mRNA 和蛋白表达. 将 p90RSK 的真核表达质粒（pMT2RSK1 ）和 p
2、AVRSKi分别与型胶原启动子荧光素酶报告基因质粒（pGL3COL1A1 ）共转染原代 HSC，48 h 后检测细胞的荧光素酶活性. 结果： 构建的 pAVRSKi 能够有效抑制 HSCT6 中 p90RSK mRNA 和蛋白表达，与对照组相比较分别减少了（70.204.04）% 和（89.105.26）%（ P0.01）. HSCT6 中型胶原的 mRNA和蛋白的表达，与对照组相比较分别减少（61.803.96）% 和（98.507.01）%（ P0.05）. 结论： p90RSK 参与了 HSC 中胶原的表达调控，可能成为肝纤维治疗的新靶点. 2【关键词】 核糖体蛋白质 S6 激酶类；肝/
3、细胞学；星形细胞；胶原型；RNA 干扰0 引言核糖体 S6 激酶（ 90KDa ribosomal S6 kinase, p90RSK）隶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，是细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase 1 and 2, ERK1/2）信号转导通路的重要效应分子，具有在多种细胞内调控基因转录、细胞周期以及维持细胞生存等生物活性1-2 ，在肿瘤的发生及神经系统发育中具有重要的调控作用3. 活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）是肝纤维化时细胞外基质的主要来源和发生、发展的中心环节4 . 研究5-6表明
4、 p90RSK 在肝纤维化中表达增加，并参与诱导 HSC 的凋亡. 然而 p90RSK 是否参与调节HSC 内胶原的表达及其可能机制，目前国内外尚少见报道. 本实验采用 RNA 干扰、报告基因等技术，研究 HSC 内 p90RSK 调节胶原表达及其分子机制，为临床治疗肝纤维化提供新的思路.1 材料和方法1.1 材料雄性 SD 大鼠 250300 g（南京军区南京总医院实验动物中心） ；pMT2RSK1 由美国哈佛大学医学院 Avruch 教授惠赠. 3pAVU6+27 由美国密歇根大学生物化学实验室 Engelke 教授惠赠. 携带大鼠型胶原启动子及萤火虫荧光素酶基因的 pGL3COL1A1由
5、东南大学实验中心提供. 肝星状细胞株 HSCT6 由美国西奈山大学肝脏中心实验室 Friedman 教授惠赠，其表型为活化的 HSC. 小鼠抗大鼠 RSK 抗体（美国 BD 公司） ；兔抗大鼠型胶原抗体（武汉博士德公司） ；荧光素酶检测试剂盒（美国 Promega 公司） ；CK40 型电转化仪，iCyclerTM 光学荧光定量 PCR 仪，PAC3000蛋白电泳仪，半干转膜仪（美国 BIORAD 公司） ；CK40 倒置显微镜（日本 Olympus 公司） ；聚偏二氧乙烯膜（PVDF ） （美国Schleicher & Schuell 公司） ；LipofectamineTM2000 试剂（
6、美国 Invitrogen 公司） ；牛血清白蛋白（美国 Sigma 公司）.1.2 方法1.2.1HSC 原代细胞的分离培养大鼠称重后以戊巴比妥钠 30 mg/kg 腹腔注射麻醉后，以 10 U/L 肝素钠 1 mL/kg 将大鼠肝素化，暴露门静脉，插管，以 37无钙灌流液预灌流， 4050 mL/min，持续约 10 min；其后用酶灌流液继续灌流， 4050 mL/min，持续时间为 1015 min. 取出肝脏，剪碎、消化、过滤，滤液离心，1700 r/min，离心 7 min，弃上清，用 DHanks 清洗，1700 r/min，离心 7 min；弃上清，沉淀以 12 体积的 180
7、 g/L 的Nycodenz 混匀，行密度梯度离心， 3400 r/min，离心 17 min；4取界面处细胞，用 DMEM 清洗 2 次，1700 r/min，离心 7 min；取沉淀细胞悬浮于含 200 mL/L 小牛血清的 DMEM 中，用台盼蓝染色判断存活率；将细胞以 1105/cm2 接种于培养皿，置 37，50 mL/L CO2 培养箱培养，24 h 细胞贴壁后换液；倒置显微镜下观察所分离的 HSC 形态和培养后的形态变化；在荧光显微镜 328 nm 波长的紫外光激发下，观察 HSC 的自发荧光.1.2.2RNAi 载体的构建及鉴定通过网站的 siRNA 设计软件，设计针对大鼠 p
8、90RSK 的特异性 siRNA：Forward oligo：TCGACAAAAGAGATCCCTCCGAAGTTCGCTTCGGAGGGATCTCTTTTTTTT；Reverse oligo：CTAGAAAAAAAAGTAGATCCCTCCGAAGCGAACTTCGGAGGGATCTCTTTTG ，由上海申友生物工程公司合成. 将合成的片段分别溶于双蒸水中，配制成 100 pmol/L 的溶液，将引物进行退火、磷酸化. pAVU6+27 空载质粒进行酶切线性化，并将酶切产物纯化后与合成的引物于 16连接过夜后感受态细菌（ DH5）转化，构建p90RSK 的特异性质粒 pAVRSKi，质粒抽提
9、、酶切鉴定 .51.2.3HSC 细胞转染应用 LipofectamineTM2000 试剂进行pAVRSKi 瞬时转染 HSCT6 细胞株（表型为活化状态的 HSC） ，以 pAVU6+27 空载体作为对照. 转染当日，在 1.5 mL 离心管中以250 L 无血清、无抗生素的 DMEM 培养液稀释 4 g 目的质粒，充分混匀. 同时，在另一 1.5 mL 离心管中以 250 L 无血清、无抗生素的 DMEM 培养液稀释 10 L 脂质体，并于 5 min 内将其与DNA 稀释液混合 . DNA脂质体混合物在室温下放置 3045 min. 在此期间，以新鲜 DMEM 培液（含有血清但无抗生素
10、）洗涤细胞2 次，然后加入 1 mL 相同培液. 将 500 L DNA脂质体混合物加入 6 孔培养板中，前后摇动，使其充分混匀，放置于 37，50 mL/L CO2 培养箱中培养. 在质粒转染 12 h 后加入等体积新鲜含血清培养基，转染 2448 h 后收集细胞进行目的基因的实时定量PCR 和 Western Blot 检测.共转染：在进行报告基因检测中，采用原代分离培养的 HSC 细胞. 各组细胞分别转染 p90RSK 的表达质粒（pMT2RSK1 ，1 g） ，RNA 干扰质粒（pAVRSKi, 1 g） ，pGL3basic （1 g,基础对照），pGL3control （1 g，阳
11、性对照）外，均再加入pGL3COL1A1（1 g）和 pRLSV40（0.1 g，为内参）共转染，24 h 后，弃去转染液，加入正常细胞培养液，继续孵育至 48 h，进行荧光素酶活性检测.61.2.4 实时定量 PCR 检测 p90RSK 和胶原 mRNA 的表达提取转染组和对照组细胞总 RNA，逆转录合成 cDNA 模板，进行目的基因的 PCR 扩增，产物 10-1 倍比稀释，制备标准曲线样品 . 采用荧光定量 RCP 仪分别扩增目的基因和内参基因，测定标准曲线和熔解曲线，用 Ct 值表示样品中模板的相对含量. 荧光定量 RCP 的反应体系与条件：25 L 反应体系，正、负引物（10 mol
12、/L）各 0.5 L，Takara 2PCR Master mix 12.5 L，模板 1.0 L，加水补足. 预变性 94 2 min，94 15 s，60 20 s，72 20 min，共 40个循环. 产物熔解曲线测定条件为：95 1 min，72 1 min，每升高 0.5保持 30 s，至 95. RTPCR 使用的正向引物（F ）和反向引物（R）包括：p90RSK（F）TCTCTGTCCAGCGGCGGGTGAGGA；p90RSK（R ）GCATTCACAGCGCCCATGCGCAG；Collagen（F ）CCAGCCGCAAAGAGTCTACATGTC；Collagen （R
13、）ITCACCTTCTCATCCCTCCTAA；18 sRNA（F）GTCTGTGATGCCCTTAGATG；18sRNA（ R）AGCTTATGACCCGCACTTAC.1.2.5Western Blot 检测 p90RSK 和胶原蛋白的表达吸去细胞培养液，1PBS （0.01 mol/L, pH7.4）洗涤后加入裂解液（10 mmol/L Tris(pH7.58.0), 25 mol/L NaCl, 10 mL/L TritonX100, 10 g/L Protease inhibitor） 冰上放置 20 min 后7收集裂解液，4，13 000 g,离心 30 min，收取上清，进行福
14、林酚法蛋白定量. 取 20 g 蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶（ 50 g/L 沉积胶，100 g/L 分离胶）电泳分离样品，转印至 PVDF 膜. 50 mL/L 牛血清白蛋白，4封闭过夜后，一抗（ 11000 稀释）室温孵育 3 h， PBST 充分洗涤后加入二抗（15000 稀释）室温孵育 2 h， PBST 充分洗涤，鲁米诺和增强子（ECL plus）室温孵育 2 min后 Kodak 增感胶片曝光检测. 以 actin 为内参照.1.2.6 荧光素酶报告基因活性检测转染 48 h 后，以 PBS 洗涤细胞 2 次，每孔细胞加入 1reporter lysis，离心收集上清，取 20 mL
15、上清按照检测试剂说明书操作，用化学发光检测仪检测荧光素酶的活性.统计学处理：采用 SPSS11.0 统计软件进行方差分析，数据以xs 表示. P0.05 为差异有统计学意义.2 结果2.1P90RSKRNAi 真核表达载体的构建空载质粒 pAVU6+27 的酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，在 300 bp 附近可见一条带，而干扰质粒 pAVRSKi 的酶切产物经 15 g/L 琼脂糖凝胶电泳，在 350 bp附近可见一条带（图 1） ，并将酶切产物纯化后测序鉴定，说明含52 bp siRNA 的 p90RSKRNAi 真核表达载体构建完成 .82.2P90RSKRNAi 对 HSC 中型胶原 mRNA 表达的影响实时定量 PCR 结果显示，转染 pAVRSKi 后，HSC 的 p90RSK mRNA的表达与对照组比较减少了（70.204.04）% ，型胶原 mRNA的表达与对照组比较减少了（61.803.96）% （P0.01） ，两者表达变化方向一致.2.3P90RSKRNAi 对 HSC 中型胶原蛋白表达的影响 Western Blot 检测结果显示，转染 pAVRSKi 后， HSCT6 的 p90RSK 和型胶原的蛋白表达较对照组减少了（89.105.26）% 和（98.507.01）%（ P0
