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1、1树突细胞免疫对 HPV 感染阳性角朊细胞生物学特性影响作者：严泉剑，张菊，闫小君，段杰，赵锦荣，张宇梅，苏成芝 【关键词】 树突细胞 关键词 :树突细胞;乳头状瘤病毒，人;角蛋白细胞;细胞周期;T淋巴细胞，细胞毒 摘 要: 目的 观察树突细胞免疫对 HPV 感染阳性角朊细胞（HIPK）增殖特性的影响及诱发杀伤性 T 淋巴细胞（CTL）细胞毒活性的变化. 方法 用计数法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪（FCM ） ）检测 DNA 含量及细胞周期的变化，以观察 HIPK 增殖特性变化.同时用 51 Cr 释放法测定树突细胞免疫前后细胞毒性淋巴细胞（CTL）对 HIPK 的细胞毒作用 . 结果 树突细
2、胞免疫后，HIPK 生长延缓，增殖幅度降低，倍增时间（Dt）延长，HIPK 的 Dt 为24.7h，DCs 细胞培养上清作用后 HIPK 的 Dt 为 41.6h.FCM 检测HIPK 的 G0/G1，S ，G2/M 各时相细胞百分比（ %）分别为:57.6，28.5，13.9;DCs 细胞培养上清作用组分别为61.7，20.3，11.2.两者增殖指数（PI）比较差异显著（P0.01）. 另外没有观察到 HIPK 凋亡，而 DCs 培养上清作用组却观察 6.8%的凋亡率. 251 Cr 释放实验中，效- 靶比为 101，51，21 时，DCs治疗组 CTL 对 HIPK 杀伤率（ %）分别为
3、37.6，21.4，13.7;而对照组为 5.6，2.9，1.6. 结论 树突细胞免疫后 HIPK 出现了一定的增殖抑制现象，同时诱导了 CTL 的杀伤作用. Keywords:dendritic cells;papillomavirus，human;ker-atinocyte;cell cycle;T-lymphocytes，cytotoxic Abstract:AIM To investigate the characteristic change of HPV infection positive keratinocytes（HIPK）in culture after dendritic
4、 cell immunization.METHODS By comparing the difference of the growth curve with cytometre assay，DNA content and cell cycle of HIPK with flow cytometre（FCM）assay，we studied the growth characteristic distinctness of HIPK cultured with the supernatant of dendritic cell and the cytotoxicity alteration o
5、f the cytotoxic lymphocyte（CTL）to HIPK was evaluated with 51 Cr release assay.RESULTS Af-ter dendritic cell immunization，the HIPK proliferation was lagged，The double proliferation time（Dt ）of HIPK was24.7h，and the Dt of HIPK treated with supernatant of DCs was41.6h.With FCM 3assay，the percentage（%）o
6、f the cells at distinct stage G0/G1，S，G2/M phase of HIPK was57.6，28.5，13.9while the percentage of HIPK cultured with the supertant of DCs was61.7，20.3，11.2respectively.The pro-liferation indexes of them were significantly different（P0.01，2 test）.When effect/target ratios were10:1，5:1 ， 2:1，the cytot
7、oxicity rates（ 51 Cr release rate/%）of DCs treated group were37.6， 21.4，13.7respectively，while those of con-trol group were5.6，2.9 ，1.6respectively with 51 Cr release assay.The significant differences between them（P0.01）were evaluated by2 test.The apoptosis was found only in HIPK treated with supern
8、atant of DCs，whose apoptotic per-centage was6.8%assayed with FCM.CONCLUSION Den-dritic cell immunization can restrain proliferation of HIPK as well as killing it by activated CTL. 0 引言 树突细胞（DCs）是已知的体内功能最强的专职抗原递呈细胞，对于外源性抗原能通过所谓 cross-priming 的机制诱导出MHC类限制性的 CD8+ CTL.目前用肿瘤抗原肽、肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞 RNA 体外冲击 DCs
9、或将 TAA 基因转移到 DCs 内，有效诱导活化特异性的 CTL 均被认为是颇有前途的肿瘤治疗方案41-3 .人乳头瘤病毒（HPV ）是一种常常感染复层上皮细胞并引起乳头瘤样改变及良恶性肿瘤的小 DNA 病毒.传统的治疗方法效果差，复发率高，主要与感染 HPV 患者不能产生有效的细胞免疫有关4 .树突细胞免疫治疗 HPV 感染引起的尖锐湿疣，效果较好，因而也是一种颇有前途的治疗方法5 .我们观察了树突细胞免疫对 HIPK 增殖特性的影响及诱导杀伤性 T 淋巴细胞（ CTL）细胞毒活性的变化. 1 材料和方法 1.1 材料 HPV 感染阳性角朊细胞、正常角朊细胞系为本所培养.树突细胞按文献6
10、获取.实验组效应细胞为 HPV 感染阳性角朊细胞提纯抗原冲击人外周血树突细胞后，免疫病人 4wk 后所得外周血细胞毒性 CD8+ T 淋巴细胞.对照组则未行免疫治疗.培养条件为50mLL-1 CO2 ，37.培养基为 RPMI1640 培养液含100mLL-1 小牛血清和抗菌素（青霉素0.1uL-1 ，链霉素 0.1uL-1 ）. 1.2 方法 生长曲线测定:采用细胞计数法7 .将 HIPK 以 5104 /孔的密度接种 24 孔板，分 8 组，每组 3 个复孔，培养 12d，每 3d换液 1 次，其中一组每次换液时加入 HPV 抗原刺激 DCs24h 培养5上清 0.5mL.第 4 日开始计
11、数，每日检测一组，根据原始数据绘制细胞生长曲线，计算倍增时间.细胞周期的测定:收集细胞，PBS 洗涤两次，700mL.L-1 乙醇固定，加入 DNA-Prep stain 染液 500L染色 DNA20min，ELITE ESP 型流式细胞仪（FCM）测定每个细胞的荧光强度，每份标本检测 10000 个细胞，用 DNA MultiCycle 软件进行统计学拟合分析.CTL 的杀伤活性检测用 51 Cr 释放法测定树突细胞免疫前后细胞毒性淋巴细胞（CTL）对 HIPK 的细胞毒作用8 .于 96 孔培养板中加入不同的效应细胞和靶细胞比例101，51，21（每种比例重复 3 孔）.特异性 51 C
12、r 释放率按如下公式计算:（a-b）/） （c-b） 100，a 是效应细胞作用后靶细胞上清的放射活性，b 是自发释放放射活性， c 是最大释放放射活性. 统计学处理: 应用 METLAB，SPSS 及 EPI6 软件进行统计学分析. 2 结果 2.1 细胞生长曲线及倍增时间 以培养 412d 的细胞数作图，绘制出细胞生长曲线.DC 细胞培养上清作用下细胞生长曲线上升较缓，生长率明显低于对照HIPK，HIPK 倍增时间为 24.7h，DC 细胞培养上清作用后 HIPK 倍6增时间为 41.6h，HIPK 细胞生长数量明显减少，速度减慢（Fig1）. 2.2 树突细胞免疫对 HIPK 细胞周期及
13、 CTL 的影响 FCM 检测树突细胞免疫前后 HIPK 细胞的 DNA 含量，经计算机处理，得出 G0/G1，S，G2/M 各时相细胞百分比（ %）.对照组 HIPK 分别为 :0.58， 0.28，0.14;DC 细胞培养上清组分别为0.62，0.24，0.14.两者 PI 比较差异显著（P0.01vs Con-trol）照组 HIPK 没有观察到凋亡，而 DC 细胞培养上清作用组却观察 6.8%的凋亡率.，DC 治疗前后 CTL 活性有明显差别（Fig2（略） ）. 3 讨论 在某些情况下，由于 CTL 关键表位的改变，多肽抗原与MHC 的结合受表位的突变，多肽抗原与 MHC 的结合受到
14、抑制，或TCR 的识别过程受到影响，则可能影响免疫应答过程而导致病毒逃避现象的产生9-11 .抗原呈递过程中，病毒编码蛋白所引起免疫逃避的有以下几个主要方面.抗原呈递过程中的病毒免疫逃避.在依靠 MHC类分子限制的 CD8+ 细胞毒 T 细胞来清除被病毒感染的细胞这一过程中，病毒编码了一些蛋白产物影响抗原呈递过程的各个环节（如蛋白酶降解作用12，13 、抗原多肽的运输14，15 、MHC类分子的形成16-19 等） ，从而逃避免疫7系统的清除.胞内途径中的病毒免疫逃避:MHC类分子限制的抗原呈递多与胞内途径相关联.病毒某些基因编码蛋白能直接或通过控制细胞因子的产生而控制胞内途径.结晶结构分析表
15、明，EB 病毒基因 BCRF1 编码的病毒 IL-10（vIL-10） ，能阻止抗原多肽结合的MHC类分子在感染细胞表面的显现 20 ，也能降低 TAP1 在B 细胞中的表达，从而减少 B 细胞表面 MHC类分子的数量21 .另外，在胞内途径中， AT-1 即 TGN 特异的包涵体连接体，主要介导跨高尔基体网和胞膜的蛋白分选22 .MHC 类分子和抗原多肽在胞内途径的分选，都是由 AP-1 或 AP-2 介导的，牛乳头瘤病毒（BPV）编码的 E6 蛋白，能够影响 AP-1 介导的 MHC类分子分选入胞内途径 23 .有证据表明 HPV16E6/E7 基因，因缺乏能够提呈 E6/E7基因编码抗原
16、特定的 MHC-类分子的特定序列 TAP-1 分子24 ，使得 HPV16E6/E7 蛋白在宿主体内不被提呈而逃脱了宿主的免疫监视.尖锐湿疣治愈率低及易复发原因多数为 HIPK 细胞出现免疫逃避.DC 免疫治疗尖锐湿疣就是获取患者外周血中的 DC，利用合成的细胞因子及提纯的病毒抗原蛋白刺激其成熟，回输患者局部应用，此方法从多个环节打破了病毒免疫逃避的机制.本实验中观察到 DC 免疫治疗后，患者的 CTL 杀伤 HIPK 的能力明显增强，提示治疗过程中患者的 DC 抗原递呈能力得到了加强. DC 本身可分泌各种细胞因子有效调节免疫25 ，pDC28能产生 863107 L-1 的 IFN26 ，我们观察到DC 分泌到上清中的物质能抑制 HIPK 的生长，使其倍增时间延长，诱导产生凋亡，推测为 DC 分泌 IFN 起作用. 参考文献: 1Mulders
