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1、1染料木黄酮对帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元的保护作用作者：杨延东 高全桂 陈文芳 【摘要 】 目的 探讨染料木黄酮对 1甲基4 苯基1,2,3,6四氢吡啶（MPTP ）制备的帕金森病（ PD）模型小鼠多巴胺能神经元的保护作用。方法 将 C57BL6 雄性小鼠随机分为正常对照组、MPTP 模型组及染料木黄酮预处理组。用逆转录 聚合酶链式反应（RTPCR ）技术检测黑质酪氨酸羟化酶（TH）及多巴胺转运体(DAT) 基因的表达水平。应用高效液相色谱法检测纹状体（Str）内 DA 及其代谢物二羟基苯乙酸（ DOPAC）含量。结果 MPTP 模型组黑质 TH 和 DAT 基因的表达较正常对照组明显降低
2、，染料木黄酮预处理组可逆转上述改变（F=20.31、13.19,P0.01)。MPTP 模型组 Str 内 DA 及其代谢产物 DOPAC 的含量较对照组明显减少，应用染料木黄酮后可逆转上述改变(F=63.58、16.12,P0.01)。结论 染料木黄酮对 MPTP 制备的PD 模型小鼠黑质纹状体 DA 能神经元有明显的保护作用。 【关键词】 帕金森病 染料木黄酮 1 甲基 4 苯基 1 2 3 6 四氢吡啶 黑质 纹状体 ABSTRACT Objective To investigate the protective effect of genistein on doparminergic
3、neurons. Methods 2C57BL6 mice were randomly divided into three groups: control group (DMSO, ip), MPTP group (15 mg/kg, ip) and genisteinpretreatment (10 mg/kg, ip) group. The changes of tyrosine hydroxylase (TH) and dopamine transport (DAT) gene expression in substantia nigra (SN) were detected by u
4、sing reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR). The contents of DA and its metabolites dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) were determined by high performance liquid chromatographyelectrical chemical detection (HPLCECD). Results Genistein pretreatment could prevent the MPTPinduced decrea
5、se of TH and DAT gene expression (F=20.31,13.19;P0.01). MPTP significantly decreased the levels of dopamine (DA) and its metabolites dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) in the striatum, which could be restored by genistein pretreatment (F=63.58,16.12;P0.01).Conclusion Genistein has neuroprotective ef
6、fects on dopaminergic neurons against MPTPinduced mouse model of PD. KEY WORDS Parkinsons disease; Genistein; 1methy4phenyl1,2,3,6Tetrahydropyridine; Substantia nigra; Striatum 3帕金森病（PD）是一种中枢神经系统退行性疾病，其主要病理改变是中脑黑质(SN)多巴胺（DA）能神经元选择性丧失和纹状体（Str）DA 含量显著减少1,2。目前对 PD 的治疗手段不断发展，可分为药物治疗、基因治疗和外科治疗等，左旋多巴是公认的治
7、疗PD 最有效的药物，但这类制剂长期应用后的副作用限制了其在临床的应用，因此探寻新的治疗方法是当前研究的热点。大量的流行病学资料已证实，染料木黄酮对神经退行性疾病、骨质疏松及心血管疾病具有一定的防治作用。但染料木黄酮对 PD 模型雄性小鼠黑质DA 能神经元是否具有保护作用目前尚未见报道。本研究应用 1甲基4 苯基1,2,3,6 四氢吡啶（MPTP ）建立 PD 模型小鼠，研究染料木黄酮对黑质酪氨酸羟化酶（TH）和多巴胺转运体(DAT)基因表达以及纹状体 DA 及其代谢产物含量的影响，以期为 PD 的防治提供进一步的实验依据。现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 实验动物和药品 选用健康雄
8、性 C57BL6 小鼠 18 只，体质量为(202)g,由北京维通利华动物实验中心提供，合格证号：SCXK（京）20020003。置于（ 19.02.0）室温下，以 12 h12 h 昼夜循环光照，自由进食、饮水。动物于实验前适应实验室环境 1 周。染料木黄酮为上海同田生化技术有限公司产品；MPTP、DA 和4DOPAC 均为 Sigma 公司产品；逆转录试剂盒为 PROMEGA 公司产品；Tag DNA 聚合酶为 TAKARA 公司产品。 1.2 实验动物造模与给药 实验动物随机分为正常对照组、MPTP 模型组和染料木黄酮预处理组，每组 6 只。 3 组动物每天 8：00 时先行腹腔注射二甲
9、基亚砜（DMSO) 或染料木黄酮(10 mg/kg)，连续 3 d；MPTP 模型组于第 4 天注射 DMSO 后 2 h 开始腹腔注射 MPTP(15 mg/kg)，连续注射 4 次，每次间隔 2 h，自第 5 天开始继续腹腔注射 DMSO，连续 4 d；染料木黄酮预处理组于第 4 天注射染料木黄酮后 2 h 开始腹腔注射 MPTP(15 mg/kg)，连续注射 4 次，每次间隔 2 h，自第 5 天开始继续腹腔注射染料木黄酮，连续 4 d。 1.3 RTPCR 检测 末次注射 24 h 后断头取脑，快速取双侧 SN，加 TRIzol 试剂提取总 RNA。总 RNA 经紫外线分光光度计定量后
10、 ,参照试剂盒说明书建立 20 L RT 反应体系：取 3 g 总 RNA 加 5 mmol/L MgCl2 4 L、10逆转录反应缓冲液 2 L，1 mmol/L dNTP 各 2 L，AMV 逆转录酶 15 U 0.5 L， RNase Inhibitor 0.5 L，Olig（dT ）15 引物 1 L，加无 RNase 水至 20 L，42 反应 1 h，99 加热 5 min，然后快速冷却到 4 。反转录得到的cDNA 用作 PCR 反应模板，或暂放-20 保存。建立 25 L PCR 5反应体系：在 3 g RT 产物中加入 25 mmol/L MgCl2 1.5 L，10逆转录反
11、应缓冲液 2.5 L，dNTP 各 2 L,上下游引物各 1 L，Taq DNA 聚合酶 0.2 L，加无 RNase 水至 25 L。TH 基因上游引物序列：5AAAATCCACCACTTAGAGACC3 ，下游引物序列：5AGCCACAGTACCGTTCC3, 扩增产物长为 467 bp。DAT 基因上游引物序列：5AAGATCTGCCCTGTCCTGAAAG3，下游引物序列：5CATCGATCCACACAGATGCCTC3,扩增产物长为 540 bp。GAPDH 基因的上游引物序列：5GACCACAGTCCATGCCATCAC3，下游引物序列：5GCTGTTGAAGTCGCAGGAGAC
12、3,扩增产物长为 340 bp。 8 L 的 PCR 产物经含有 0.5 mg/L 溴化乙锭的 20 g/L 琼脂糖凝胶电脉观察，并与 100 bp Marker 进行比较。PCR 产物经数据分析装置（Alphaimager 2200）观察影像并进行密度分析,用 TH、DAT与 GAPDH 比值表示各基因的表达水平。 1.4 高效液相色谱法（ HPLC）检测 小鼠断头取脑，取出单侧纹状体，称质量，加入 300 L 冰冷的样品预处理 A 液，超声匀浆 10 s 后，冰浴静置 1 h，取匀浆液4 下 12 000 r/min 离心 20 min；移出 240 L 上清液加入样品预处理 B 液 12
13、0 L 涡旋混匀后第 2 次离心，取上清液行 HPLC 分析。设定最大柱压为 2 500 Psi，流速为 1.0 mL/min。ECD 设定电6压为 0.65 V，每一样品检测 30 min，每次进样 20 L，根据色谱峰面积从标准曲线上求出相应含量(g/g 组织湿质量)。样品预处理液如下。A 液为 0.4 mmol/L HClO4：4.6 mL HClO4 用 ddH2O 稀释至 200 mL；B 液为 20 mmol/L 柠檬酸钾（ 1.6 g）：300 mmol/L 磷酸氢二钾（13.06 g） ，2 mmol/L EDTA2Na（0.185 g）溶于 250 mL ddH2O 中。实验
14、仪器为美国 Waters 公司6007172465 高效液相色谱仪。 1.5 统计学处理 实验结果以s 表示，应用 SPSS 10.0 分析软件进行单因素方差分析。 2 结果 2.1 染料木黄酮对 MPTP 制备的 PD 模型小鼠 SN TH 及DAT 基因表达的影响 MPTP 模型组小鼠 SN TH 及 DAT 基因表达较正常对照组明显降低，染料木黄酮预处理组小鼠 SN TH 及 DAT 基因表达较MPTP 模型组明显增加，差异具有极显著意义（F=20.31、13.19,P0.01)。 见表 1。 2.2 染料木黄酮对 MPTP 制备的 PD 模型小鼠纹状体 DA 及其代谢产物含量的影响 7
15、MPTP 模型组小鼠纹状体内 DA 及其代谢产物 DOPAC 较正常对照组明显减少，染料木黄酮预处理组小鼠与 MPTP 模型组相比，DA 及其代谢产物 DOPAC 的含量明显增高，差异有显著意义(F=63.58、16.12,P0.01)。见表 2。 表 1 染料木黄酮对 MPTP PD 模型小鼠 SN TH 及 DAT 基因表达的影响（略） 表 2 染料木黄酮对 MPTP PD 模型小鼠纹状体内 DA 及其代谢产物的影响（略） 3 讨论 PD 是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，主要病变特征是累及黑质纹状体系统。MPTP 是公认的可以诱发小鼠黑质纹状体系统 DA 能神经元变性的神经毒素3。MP
16、TP 为强脂溶性化合物，极易透过血 脑脊液屏障，在单胺氧化酶 B 催化下转化为相应的二氢吡啶（MPDP+ ） ，MPDP+ 随之氧化为 1甲基4 苯基吡啶（MPP+） ，MPP+通过 DAT 进入 DA 能神经元，抑制 TH 活性，减少 DA 的合成，通过抑制线粒体氧化呼吸链、增加自由基的生成及氧化应激等导致 SN DA 能神经元凋亡4。 染料木黄酮是大豆异黄酮的主要活性成分，我们的前期研究显示，染料木黄酮可以与 ER 结合，发挥类雌激素样作用57 ，其类雌激素样作用有助于改善绝经后妇女热潮红和阴道炎等症状，对8骨质疏松症的发生也有预防作用。研究结果显示，染料木黄酮对中枢神经元具有一定的保护作用，可以保护大脑皮质神经元及海马神经元免受氧化应激及神经毒性物质的侵害8。动
