《分子技术在肿瘤靶向药物治疗的应用 (2)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子技术在肿瘤靶向药物治疗的应用 (2)（66页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分子技术在肿瘤靶向药 物治疗的应用 刘士东主任医师 中国人民解放军316医 院 肿瘤靶向治疗 Target therapy of cancer 依据已知肿瘤发生的异常分子和基因 设计和研发针对这些特定的分子和 靶点药物 选择性杀伤肿瘤细胞的治 疗方法 靶向治疗的前提就是明确肿瘤的特异 靶基因变异类存在与否和变异类型 个体化治疗的雏形 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 3 荧光原位杂交 Fluorescence in situ hybridization FISH 技术 简介 FISH Fluorescence In Situ Hybridization 利用荧光标记的DNA
2、探针检测组织或细胞内与其互 补的DNA片段 应用 遗传病诊断 血液肿瘤 实体瘤 样本 羊水 绒毛 流产组织 外周血 骨髓 体液及各种肿瘤组织等 用已知的标记单链核酸为 探针 按照碱基互补的原 则 与待检材料中未知的 单链核酸进行异性结合 形成可被检测的杂交双链 核酸 由于DNA分子在染 色体上是沿着染色体纵轴 呈线性排列 因而可以探 针直接与染色体进行杂交 从而将特定的基因在染色 体上定位 荧光标 记探针 探针变性 样本DNA变性 杂交 工作原理 FISH检测染色体易位 Translocation 在淋巴瘤分型中的应用 FISH技术在淋巴造血系 统肿瘤中的应用 检测技术特点 不同类型的淋巴瘤染
3、色体易位类型不同 优点 l适用于形态学上难以诊断且IHC结果不理想的标本 l适用于细胞数量少 形态不典型的活检及穿刺组织 必须结合组织形态学和免疫组化结果作最后诊断 FISH基因检测在淋巴瘤的应 用 弥漫大B细胞淋巴瘤 DLBCL 按免疫组化亚型分为 CD5阳性DLBCL 生发中心B细胞样变型 GCB 非生发中心B细胞样变型 non GCB 3类 可根据CD10 BCL6 MUM1的表达区分生发 中心B细胞样变型 非生发中心B细胞样变型 30 瘤细胞表达CD10或CD10 BCL 6 MUM 1 诊断为GCB 其他病例则为non GCB BCL6基因断裂 辅助诊断弥漫性大B细胞淋巴瘤 BCL6
4、基因断裂重排 判断预后 目前研究确定至少40 的DLBCL涉及BCL6基因重排 一项针对102名DLBCL患者的BCL6重排情况及其与预后关系的 研究显示 BCL6阳性患者诊断治疗36个月后 疾病停止发展 的比率为82 携带有BCL6重排的病例预后较好 BCL6 基因断裂与弥漫性大B细胞淋巴瘤 Offit K N Engl J Med 1994 331 2 p 74 80 结果判读 IGH CCND1融合基因可见于95 的套细胞 淋巴瘤 是套细胞淋巴瘤与其他淋巴瘤 鉴别的重要指标 uIGH CCND1融合基因 辅助诊断套细胞淋巴瘤 IGH CCND1融合基因与套细胞淋巴瘤 l 正常细胞 两个红
5、色信号 两个绿色信号 l 异常细胞 一个红色信号 一个绿色信号 两个融合信号 API2 MALT1基因检测试剂盒 探针 GLP API2 GLP MALT1 凋亡抑制因子2基因 apoptosis inhibitor 2 API2 位于11号染色体 粘膜相关淋巴组织基因 Mucosa associated lymphoid tissue 1 MALT1 位于18号染色体 API2基因与MALT1基因的融合导致凋亡抑制的增加 引起细胞不依赖于抗原刺激的生存优势 u API2 MALT1融合基因的检测可以指导抗 HP治疗 胃MALT淋巴瘤与幽门螺旋杆菌 HP 感染 导致的慢性胃炎有关 MALT1
6、API2融合基因阴 性的患者抗HP治疗有效 阳性患者抗HP治疗无 效 API2 MALT1融合基因检测意义 l 正常细胞 两个红色信号 两个绿色信号 l 异常细胞 一个红色信号 一个绿色信号 两个融合信号 BCL2 IGH重排发生在约80 85 的FL患者中 检测 BCL2 IGH基因重排可以辅助诊断FL BCL2 IGH阴性的FL患者3年生存率为100 而阳 性者只有54 阴性者3年疾病无进展为87 5 而阳性者只有13 BCL2 IGH融合基因与滤泡性淋巴瘤 n BCL2 IGH融合基因 辅助诊断滤泡性淋巴瘤 n BCL2 IGH融合基因 判断预后 l 正常细胞 两个红色信号 两个绿色信号
7、 l 异常细胞 一个红色信号 一个绿色信号 两个融合信号 结果判读 阳性结果 结果判读 阳性结果 约80 的伯基特淋巴瘤病例发生t 8 14 q24 q32 约15 的伯基特淋巴瘤病例发生t 2 8 p11 q24 约5 发生t 8 22 q24 q11 染色体易位导致C MYC基因断裂重组可能是伯基特 淋巴瘤的一个标志 可以应用于临床上伯基特淋巴瘤 的辅助诊断 C MYC基因断裂与伯基特淋巴瘤 u 辅助诊断伯基特淋巴瘤 结果判读 阳性结果 FISH技术在乳腺癌靶向治疗应 用 乳腺癌 Her 2基因 l 致癌基因 Her 2基因 l 位点 17q11 2 q12 l 编码蛋白 跨膜蛋白 与 表
8、皮生长因子受体部分同源 l 25 30 乳腺癌病人都有HER 2的扩 增 l HER 2基因扩增是决定Herceptin 治疗是否有效的关键性指标 lHER2扩增的乳腺癌更具有侵袭性生 长能力 乳腺癌Her 2基因及蛋白检测 Cerb B 2 3 完全强膜阳性细胞 30 2 1 FISH检测是否有基因扩增 Her2基因 检测流程 石蜡组织标本 IHC检测 再用FISH 方法检测 1 3 2 Herceptin治疗 再用FISH 方法检测 Herceptin治疗 FISH检测 再用FISH 方法检测 A 无须计数的大簇团信 号 高度扩增 B 颗粒状信号 R 10 高度扩增 C 须计数的颗粒状信
9、号 R 3 5 低度扩增 A C B Her 2基因扩增状况 30 的肿瘤细 胞全部的细胞 膜高强度着色 免疫组化 3 与FISH对比 40 100 浸润性导管癌 级 IHC FISH 呈簇团状高度扩增 100 免疫组化 与FISH扩增阳性 浸润性导管癌 级 IHC FISH 呈簇状扩增 肿瘤细胞不着色 40 100 基因突变检测方法 1 RNA酶A切割 RnaseAcleavage 2 变性梯度凝胶电泳 DGGE 3 杂合双链分析法 HA 4 化学切割错配 CCM 5 碳化二亚胺检测 Carbodiimide CDI 6 酶促切割错配 Enzyme Mismatch Cleavage EMC
10、 7 单链构象多态性 Single Strand Conformation 8 切割片段长度多态性 9 DNA测序 Sequencing 10 双脱氧指纹图谱法 Dideoxy Finger printing ddF 11 错配接合蛋白检测 12 蛋白截短测试 protein truncation test 方法 13 变性的高效液相色谱检测 Denaturing High Performance Liguld Chromatography DHPLC 14 DNA芯片技术 DNAchip 15 等位基因特异性扩增 16 等位基因特异性寡核苷酸片段分析 Allele Specific Olig
11、onucleotide ASO 17 引物延伸检测 Primer Extension PEX 18 寡核苷酸连接检测 Oligonucleotide Ligation Assay OLA 19 限制性片段分析 Restriction Fragment Analysis 20 突变体富集PCR法 mutant enriched PCR 21 蝎形探针扩增阻滞突变系统 Scorpions amplification refractory mutation system 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 35 肺癌组织EGFR基因扩增和 突变检测及其临床意义 研究背景 研究显示吉
12、非替尼对部分晚期NSCLC患者的治 疗效果非常显著 存在EGFR基因突变的患者更有可能对吉非替尼 的治疗敏感 存在EGFR基因扩增的肺癌 肠癌病人对分子靶 点药物更为敏感 检测大肠癌有无EGFR过度表达 只要 1 的 癌细胞的胞膜强阳性染色即判断为3 可作为 应用西妥昔单抗的指征 FISH检测EGFR基因扩增 l 标本类型 石蜡包埋组织 手术 活检 穿刺 冰冻组织 胸 腹水沉渣细胞 l 探针类型 GLP EGFR CSP7 定量PCR检测EGFR基因突变分型 l 突变类型 19 exon 2235 2249位点 15bp缺失突变 19 exon 2240 2257位点 18bp缺失突变 19
13、exon 2240 2251位点 12bp缺失突变 21 exon 2573位点T G碱基置换突变 21 exon 2582位点T G碱基置换突变 EGFR基因变异检测 双体性 三体性 多体性扩 增 EGFR基 因 FISH 检 测 状 况 肺 癌 石 蜡 FQ PCR分型技术检测EGFR突变 存在EGFR突变肺癌样本的琼脂糖凝胶电泳图 71例肺癌组织中检测出6例突变样本 FQ PCR 检测15bp缺失阳性病例结果 红色阈值线以上的扩增曲线即为红色阈值线以上的扩增曲线即为 阳性标本的扩增曲线 按荧光信阳性标本的扩增曲线 按荧光信 号值的高低依次为号值的高低依次为 9 9号 号 1212号 号
14、1313号 号 5555号 号 3838号和号和3333号标本号标本 15bp缺失突变型DNA的测序图 sensesense antisenseantisense 红色阈值线以上的扩增曲线红色阈值线以上的扩增曲线 即为阳性标本的扩增曲线 即为阳性标本的扩增曲线 按荧光信号值的高低依次为按荧光信号值的高低依次为 2 2号 号 3636号 和号 和4040号标本号标本 FQ PCR 检测18bp缺失阳性病例结果 目前K RAS突变检测常用技术 方法 直接测序 焦磷酸测序 高分辨率熔解曲线 PCR RFLP 芯片 杂交 Real Time PCR 肿瘤组织的确认和筛选 显微切割肿瘤 提取DNA 相应
15、的PCR反应或杂交 相关的分析和检测 K ras突变检测基本流程图 直接测序 Direct Sequencing PCR扩增后产物直接测序 双脱氧核苷酸链终止法 Sanger法 DNA 片段是荧光标记的 这些 片段经过平板胶电泳或毛细管电泳 得到分离 荧光分子被激发而发光 发出的光信号被检测系统检测 K ras突变检测结果 疗效预测标志物与预后判断标志物 疗效预测标志物 能够预测某种特定治疗方式疗效的标记物 KRAS基因突变导致肿瘤对EGFR抑制剂抵抗 预后判断标志物 在不考虑治疗因素的情况下能够判断患者结局的 标记物 18号染色体长臂 18q 缺失 某些分子标志物兼具两种作用 胸腺嘧啶合成酶
16、 Thymidylate synthase EGFR 作为预后因子的价值 EGFR expression correlates with poor prognosis DFS Disease free survival OS overall survival Cetuxamab 西妥昔单抗 人源化嵌合单抗 IgG1 靶向作用于表皮生长因子受体 EGFR 阻断EGF 和TGF 与EGFR 的结合 抑制酪氨酸激酶活性和其 后的肿瘤生长 200 年获得FDA审批资格治疗结直肠癌 Panitumumab 帕尼单抗 完全人源化单克隆抗体 IgG2 靶向作用于表皮生长因子受体 EGFR 2005年7月获得FDA快速通道审批资格治疗结直肠癌 结直肠癌分子靶向治疗药物 KRAS 突变 KRAS 突变可不依赖EGFR受体途径 自行激活 RAS MAPK 通路 导致ERBITUX 耐药 KRAS 突变与Erbitux疗效及患者生存相关 KRAS 突变并非孤立事件 KRAS 突变常伴随BRAF突变 并与 CpG 岛甲基化表型 CIMP 1 2相关 KRAS 突变常伴随 PI3K 突变3 Li vre A e
