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1、1早期自然流产患者蜕膜组织中 iNOS 的表达及意义作者:范建辉 曾韶英 滕奔琦 【摘要】 目的 通过测定早期自然流产患者蜕膜组织中诱导型一氧化氮合酶的表达,探讨其与自然流产发病的关系。方法 应用免疫组织化学法,对 41 例妇女蜕膜组织中诱导型一氧化氮合酶的表达进行检测,其中 20 例为早期自然流产患者(流产组),21 例为要求终止妊娠的正常早孕妇女(对照组) 。结果 在早期妊娠的蜕膜组织细胞浆内, 间质细胞浆内和腺上皮及腔上皮细胞浆内均有 iNOS 的表达;早期自然流产组蜕膜组织中 iNOS 的表达(2 例呈阴性,2 例呈弱阳性,10例呈阳性,6 例呈强阳性)明显强于对照组(2 例阴性,10
2、 例弱阳性,7 例阳性,2 例强阳性),两者比较,差异有统计学意义(P=0.026) 。结论 早期自然流产患者蜕膜组织中诱导型一氧化氮合酶呈高表达,iNOS 可能与自然流产有密切的相关性。 【关键词】自然流产;早期妊娠;诱导型一氧化氮合酶 【Abstract】 Objective To investigate the expression of inducible nitric oxide synthase in the decidua tissue(iNOS),and to study the role of it in the pathogensis of spontaneous abor
3、tion.Methods The expression of iNOS was measured by means of immunohistochemical method.Of 41 2women recruited in this study,20 women suffering from early spontaneous abortion(abortion group)and 21 women undergoing elective termination of normally progressing pregnancies(control group).Results Posit
4、ive staining of inducible nitric oxide synthase was localized in cytoplasm of stromal cells、glang epithelial and huminal epithelium of decidua tissue with early pregnancy.The expression of iNOS in the decidua of early spontaneous abortion group(2 negative,2 weakly positive,10 positive,6 strong posit
5、ive)were higher than those in control group(2 negative,10 weakly positive,7 positive,2 strong positive).There was statistic difference among them(P=0.026).Conclusion The obvious increase in iNOS in decidua tissue with early spontaneous abortion can be observed,which may play an important role in the
6、 genesis of spontaneous abortion. 【Key words】 Spontaneous abortion;Early pregnancy;Inducible nitric oxide synthase 自然流产是妊娠早期衰退孕囊死亡的普遍表现形式,在年轻、健康妇女中,早期妊娠的自然流产率在所有临床观测的妊娠中约为 10%,然而自然流产的确切机制仍不明确1。导致早期自然流产的原因很3多, 流产是免疫、内分泌及炎症反应等整合的结果。免疫因素在流产的过程及预防中起重要作用2。本研究拟通过测定早期自然流产蜕膜组织中诱导型一氧化氮合酶的表达,了解诱导型一氧化氮合酶在蜕膜组织中
7、表达的主要部位,探讨其与自然流产的关系。 1 资料与方法 1.1 研究对象 早期自然流产组: 选择 2007 年 10 月至 2008年 12 月在中山大学附属第三医院妇产科门诊就诊的 20 例早期自然流产患者。妊娠 10 周内,经临床病史、体征、血 HCG、B 超检查确诊为胚胎死亡。均排除解剖、遗传、内分泌、感染等因素及其他内科疾病。平均年龄(28.354.48)岁,平均妊娠天数(47.607.60)d。 对照组: 同期在中山大学附属第三医院妇产科门诊要求行人工流产终止妊娠的 21 例健康妇女。年龄 2033 岁,身体健康,月经规律(周期 2830 d),停经 70 d 内,3 个月内未服用
8、甾体类药物,未放置宫内节育器。经妇科检查,尿 HCG 检测及 B 超检查证实为宫内胚胎存活且符合孕周,排除感染性疾病及其他内科疾病。平均年龄(27.574.68)岁,平均妊娠天数(49.527.03)d。 两组孕妇的年龄及妊娠天数比较,差异均无统计学意义(P0.05)。 1.2 方法 1.2.1 仪器及试剂 电热恒温培养箱 (厦门医疗电子仪器厂) 、4微波炉(顺德格兰仕电器有限公司) 、日本奥林巴斯显微镜 BX51。试剂主要有:兔抗人 iNOS 多克隆抗体( 浓缩型)(Santa cruz 公司),二抗(羊抗兔) 、 SBC 复合物、APES 粘片剂均购至福州迈新公司, 水性封片剂, 迈新试剂
9、 AEC-0038(福州迈新公司) 。 1.2.2 测量方法 各组均在确诊后,在常规消毒铺巾下用膜式电动吸引器行吸宫流产术,负压 4060 KPa,即刻收集蜕膜组织,生理盐水冲净血液后,10% 中性缓冲福尔马林( 浓甲醛 10 ml,0.01M,pH:7.4,PBS 90 ml)固定 24 h 以制备石蜡切片。石蜡包埋切片厚度为 5 um。切片常规脱蜡至水 ,用 3%H2O2。浸泡灭活内源性酶,在滴加正常山羊血清封闭液前切片均需微波修复抗原,而后依次加入正常山羊血清封闭液、稀释的一抗、二抗工作液、链酶亲和素一过氧化物酶复合物,DAB(3,3-2 氨基联苯胺)显色,封片。所有试验均采用在同一条件
10、下进行。结果判定,iNOS 表达在细胞浆上,判定标准以细胞浆出现明显的棕黄色颗粒为阳性,无着色或与背景颜色一致为阴性;随机选择 5 个高倍视野,根据多数细胞的染色强度计算强度得分,无着色为 0 分,淡棕黄色为 1 分,棕黄色为 2 分,深棕黄色为3 分; 阳性率和强度计分相加的结果:01 分为(-),2 分为(+),34 分为(+),56 分为(+) 。 1.2.3 统计学处理 全部统计学分析均采用 SPSS14.0 软件包进行, 等级资料采用 WIcoxon 秩和检验分析。 2 结果 52.1 iNOS 在蜕膜组织中的表达 21 例正常早孕组蜕膜组织中iNOS 的表达在细胞浆内,间质细胞浆内
11、有表达 ,2 例不着色为阴性,10例弱阳性染色,7 例呈阳性染色,2 例呈强阳性染色;腺上皮及腔上皮细胞浆内也有 iNOS 的表达,其中 13 例呈弱阳性染色,4 例呈阳性染色,2 例呈强阳性染色,2 例呈阴性。 20 例自然流产组蜕膜组织中 iNOS的表达均在细胞浆内,间质细胞内有表达, 其中 2 例不着色,2 例呈弱阳性染色,10 例呈阳性染色 ,6 例呈强阳性染色;腺上皮及腔上皮细胞也有表达,其中 4 例不着色,5 例呈弱阳性染色,5 例呈阳性染色,6 例呈强阳性染色。(图 1、2、 3、4)。 2.2 自然流产组与正常早孕组蜕膜组织中 iNOS 表达的比较 自然流产组蜕膜组织中 iNO
12、S 的表达大部分呈阳性、强阳性表达(16例),正常早孕组蜕膜组织中 iNOS 的表达大部分呈阴性、弱阳性表达(12 例),少部分阳性、强阳性表达(9 例);由此可见,流产组与正常早孕组两者比较差异有统计学意义(P=0.026),自然流产组蜕膜组织中iNOS 的表达等级强度较正常早孕组强,即流产组蜕膜组织中 iNOS的表达强于正常早孕组。(表 1) 表 1 自然流产与正常早孕蜕膜组织中 iNOS 表达( 例) 类别总例数 iNOS 6-+ 自然流产组 2022106 正常早孕组 2121072 P 值 0.026 注:P0.05 差异有统计学意义 3 讨论 3.1 正常早孕妇女和早期自然流产 i
13、NOS 的表达 既往研究表明3,4,iNOS 只表达于子宫内膜的腺上皮及腔上皮细胞,间质细胞无 iNOS 的表达; 而在早期妊娠蜕膜组织的间质细胞可见 iNOS 的表达,说明蜕膜组织的间质细胞具有表达 iNOS 的潜能,一旦处于适当的条件,就可以表现出来。本研究提示正常早孕组与早期自然流产组蜕膜组织的大部分胞浆内,包括间质细胞和腺上皮及腔上皮细胞均有 iNOS 的表达,其中以间质细胞为著。这可能与蜕膜组织间质细胞中巨噬细胞、淋巴细胞更丰富,能产生更多的细胞因子有关。 3.2 正常早孕组与早期自然流产蜕膜组织 iNOS 表达变化的意义 NO 是一种免疫活性分子,广泛分布于机体各组织和细胞浆内 ,
14、具有重要的免疫学功能。NO 不仅能调节酶活性 ,改变血管紧张性,调节血小板功能,而且参与炎症反应、神经传导、淋巴细胞增殖过程,以及多种女性生殖过程,如排卵、种植、维持妊娠、调节分娩、调节月7经周期,并且还是介导巨噬细胞毒作用及细胞凋亡的关键介质4,5,6 。NO 来源有赖于关键酶 NOS 的作用。既往研究表明, 与免疫有关的主要是诱生型 NOS(inducible NOS,iNOS),iNOS 可在单核巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等多种免疫活性细胞中表达。iNOS 通过 cGMP 使 T 细胞封闭于 G0/Gl 期,不能对 IL-2R 产生应答,细胞免疫下降即 TH1 型反应下降,从而使 N
15、O 通过调节 THl/TH2 免疫平衡维持妊娠耐受。NO 不仅是胎盘屏障的构成基础 ,而且还可以通过免疫调节在妊娠免疫耐受中发挥重要作用。当 iNOS 呈正常表达时,NO 的免疫活性在滋养细胞主要表现为免疫调节作用 ,维持妊娠免疫耐受。本研究结果显示,大部分正常早孕组蜕膜组织的间质细胞、腺上皮细胞及腔上皮细胞浆内呈弱阳性染色,即 iNOS 为正常表达。 NO 又是一种活性很高的自由基,其终产物过氧化亚硝酸根(ONOO-)有很强的毒性,能直接参与组织损伤,并介导炎症反应。iNOS 由巨噬细胞、中性粒细胞被炎性因子激活后产生, 它可催化产生大量的 NO 参与某些生理效应或病理生理过程。巨噬细胞来源
16、的 iNOS 对构成及维持胎盘屏障非常重要,在 iNOS 的参与下,小鼠着床期滋养细胞可产生 NO,从而参与血管扩张和血管形成,并介导吞噬受损伤的母体细胞的细胞毒作用,这些功能对胚胎的存活和发育具有重要意义。既往曾有研究7报道: 早期自然流产患者绒毛组织中 NO 含量较正常早孕组绒毛组织中的含量减低,其作用机制可能是因为 NO有抑制子宫平滑肌收缩的作用,而 NO 的减少可能使子宫收缩频度较正常人增加,导致流产的发生, 而其究竟是流产发生的原因还是流产引8致的结果,尚无定论。但也有报道认为, 自然流产的发生与细胞凋亡有关, 而 NO 可诱导细胞凋亡8 。有学者用 RT-PCR DNA 印迹证明胚胎未发现明显病变前,蜕膜巨噬细胞 iNOS mRNA 的表达升高与流产有密切关系,即自然流产者在流产发生前着床部位已有巨噬细胞的入侵, 侵入的巨噬细胞产生大量的 iNOS,使局部 NO 水平明显增加,产生细胞毒作用,使细胞生长停止, 导致细胞程序性死亡
