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1、第三篇 应用篇应用篇 分子诊断以DNA RNA和蛋白质为材料 通过应用分子生物学技术 检查基因的存 在 结构缺陷或表达异常 从而对人体状 态和疾病作出诊断 着重介绍感染性疾病 遗传性疾病 复杂 疾病等的分子诊断基本策略和方法 1 分子诊断的临床意义在于不仅能够对疾 病作出早期诊断 确切诊断 而且还能确 定个体归于疾病的易感性以及疾病的分期 分型 疗效监测 预后判断等 随着分子 诊断学的发展 分子诊断的原理和方法不 仅适用于遗传性疾病 而且也广泛应用于 感染性疾病 肿瘤等医学领域 从生物中心法则来看 分子诊断包括检 测基因的结构异常和基因表达异常 常见 的分子诊断方法如下 2 DNAmRNA蛋白
2、质 转 录 反转录 翻 译 PCR DNA测序 Southern blot 基因芯片 基因结构异常基因表达异常 RT PCR FQ PCR Nothern blot 基因芯片 ELISA Western blot 组织化学染色 蛋白质芯片 中心法则 检测方法 3 4 第十四章 感染性疾病的分子诊断 生物化学与分子生物学学科 2011 4 5 第一节 概 述 感染性疾病 由某种病原体所致 通过不 同方式引起人体发生感染并出现临床症 状的疾病 病原体 病毒 细菌 原虫 支原体 衣原体 立克次体 6 常规检测方法 免疫学方法 微生物学方法 受敏感性 特异性限制 不易早期诊断 并且不易提供病原体分型及
3、耐药性方面的信 息 7 分子生物学方法 聚合酶链式反应 PCR 核酸杂交 基因芯片 早期 特异地进行诊断 能提供病原体 分型及耐药性方面的信息 同时进行大量基 因的检测 8 一 感染性疾病的分子诊断 其诊断 策略可以分为以下两种 一般性检出策略 即只需要提供是否有 某种病原体的感染 完整检出策略 即不仅对病原体做出诊 断 还要进行分型 包括亚型 和耐 药性方面的检测 9 1 一般性检出策略和方法 针对特异性的核酸序列进行核酸分子探 针杂交 或者利用常规PCR技术直接检 出微生物的DNA RNA 它能够判断有 无感染和是何种病原体感染 10 2 完整检出策略和方法 按照诊断 分型 亚型 耐药性
4、检测的思路 利用多种分子诊断手段对 感染性病原体进行分析 基因芯片 基因测序等 11 二 感染性疾病分子诊断的常用方法 根据目的基因是否被放大 可分为杂交法和扩 增法 信号放大技术检测方法 靶分子数目不变 而检测的探针信号放大 采用多酶 多探针或二者结合等方法来增加探针 标志物的浓度使检测信号得到放大 靶分子扩增技术检测方法 靶分子 RNA DNA或探针 的扩增 PCR 替代扩增 LCR等 12 分支链DNA信号放大技术 bDNA 13 nucleic acid sequence based amplification NASBA 14 Figure 1 Target generation s
5、cheme for SDA This figure depicts the initial steps in an SDA reaction which transform the original target sequence into the amplification cycle depicted in Figure 2 Figure 2 The SDA reaction cycle These reaction steps continuously cycle during the course of amplification 15 引物A 靶RNA 引物B RNA cDNA RT
6、 3 5 5 5 3 5 3 5 3 cDNA cDNA模板 5 5 3 3 5 3 引物B RNAseH RT T7RNA聚合酶 100 1000 RNA扩增子 5 3 5 3 3 5 3 5 引物A 3 5 5 RNAseH RNA RNA cDNA cDNA 图图8 3 NASBA8 3 NASBA原理示意图原理示意图 引物引物A A 5 端 带有T7RNA 聚合酶结合位 点 3 端碱 基与靶RNA 3 端序列互 补 引物引物B B的碱 基序列与 cDNA 3 端 序列互补 16 三 感染性疾病分子诊断的标本处理 标本采集处理主要包括选择合适的标本种 类 标本量 抗凝剂等及对标本进行合适
7、 的传送 保存和预处理 17 四 感染性疾病分子诊断的结果解释 1 阴性结果 假阴性可能性 方法的灵敏度太低 方法失败 目标分子 2 阳性结果 假阳性可能性 方法的特异性 受到污染 18 3 定性检测结果 有时不能提供病原体活力相 关信息 临床治疗病情缓解后一定时间内 在患者 样本中仍可以检测出相应的病原体 有些病原体潜伏在进体内 没有临床症状 4 疾病状况的判断 检测出病原体的存在并不 能说此病原体就是引起疾病的直接原因 该病原体可能是一种正常菌群 19 五 感染性疾病分子诊断的临床应用 及评价 用于感染性疾病治疗的监控和预测 病情 发展过程的危险性评价及疾病预后等 耐用性的检测 细菌的分型
8、 流行病调查 20 第二节 病毒的基因检测 人类许多感染疾病由病毒引起 如病毒性肝 炎 脑炎 流行性感冒等等 占人类传染疾 病的75 左右 400多种不同病毒 病毒结构 大 小 20 300nm 核心区 核酸 DNA或RNA 外周衣壳 蛋白质 包膜 脂质 镶嵌有蛋白质 21 我国是HBV高流行区 50 70 的人 受过感染 8 10 是HBV携带者 肝 炎患者中60 是慢性肝炎患者 导致肝硬 变 HBV又与原发性肝癌密切相关 外壳 HBsAg 外壳蛋白成分为表面抗原 核心 HBcAg DNA DNA 聚合酶 HBcAg 一 乙型肝炎病毒 22 Dane颗粒 完整的病毒 形态 HBsAg HBc
9、Ag HBV DNA DNAPol 外膜蛋白 核衣壳蛋白 完整的乙肝病毒颗粒直径42纳米 由双层外壳和一个核心组成的 核心直径为27纳米 内含DNA双链和DNA多聚酶23 一 病毒基因组结构 3 2kb双链DNA病毒 不完全双连环状DNA 长链L为负链 有4个开放阅读框S C P X S区编码外膜蛋白 HBsAg C区编码HBeAg HBcAg p区编码DNA聚合酶 X区位编码X蛋白 可能与病毒蛋白表 达有关 短链S为正链 长短不一 24 pre s1 pre s2S P C pre c X HBV DNA 3 2 kb pre S1 pre S1 蛋白 pre S2 pre S2 蛋白 S
10、HBsAg pre C HBeAg C HBcAg P DNAP X HBxAg HBV基因组结 构 25 26 27 28 二 分子诊断 常用的免疫学检测方法 即二对半的检测存 在窗口期 不易早期诊断 1 PCR 采用普通PCR FQ PCR 竞争性PCR 免 疫杂交PCR 可提供直接 准确的病原学诊 断证据 引物是根据S C P X基因中高度 保守序列设计 决定扩增的特异性和敏感度 29 扩增位置 引物序列 扩增片断 bp P X基因 5 ATACTGCGGAACTCCTAGC 3 278 5 CCGCGTAAAGAGAGGTGCG 3 C基因 5 ATACCACAGAGTCTAGACTC
11、GTGGTGGACT 3 477 5 AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC 3 C基因 5 GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA 3 258 5 ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA 3 30 有时为了证实扩增产物的特异性 对扩增产 物进行以下分析 RLFP 斑点杂交 Southern杂交 31 2 支链DNA信号放大技术 bDNA 原理 捕获探针 检测 靶探针1 体系 靶探针2 bDNA分子 DNA主链上结 合多个侧链 32 捕获探针固化在微孔板上 靶探针1分别与捕获探针及待测核酸杂交 靶探针2分别与待测核酸及bDNA杂
12、交 形成复合物 固相支 持物 捕获 探针 靶探 针1 CEs 待测 核酸 靶探 针2 LEs bDNA 复合物 33 分支链DNA信号放大技术 bDNA 34 信号检测 bDNA可结合很多酶标探针 酶 催化底物 1 2 二恶二酮 dioxetane 发 光 使核酸信号放大 且发光强度与DNA量 成正比 优点 放大倍数确定 阳性检出率高 稳定性和可重复性好 操作简便 省时 易于普及 35 支链DNA技术 36 3 基因芯片技术 标本经PCR扩增后与芯片上的特异探 针进行杂交 可以检测 是否有病毒感染 感染病毒的种类及亚型 病毒的耐药情况 特点 可同时进行大量标本的检测 37 近年来陆续上市的核苷
13、 酸 类似物对HBV的治疗压力集中在P区 干扰素治疗对HBV的压力主要集中在前C C区及前S区 HBVHBV耐药突变耐药突变 lamivudine adefovir entecavir telbivudine 38 39 40 三 临床意义 1 早期诊断 免疫学检测敏感性 0 1 g ml 核酸杂交检测敏感性 0 1pg ml PCR检测 0 1fg ml 因此 在感染早期即可通过DNA检测证实 病毒的存在 41 2 监测治疗效果 HBVDNA 107拷贝 ml提示病毒复制活跃 HBVDNA 104拷贝 ml治疗有一定疗效 HBVDNA 103拷贝 ml HBeAg阴转 转氨酶正常为乙型肝炎临
14、床治愈指标 3 判断病情 指导制定合理的治疗方案 42 4 病毒耐药性的检测 乙肝病毒DNA聚合酶YMDD处的突变是 病毒产生耐药性的重要原因 通过监测 YMDD的突变情况 可以获得病毒耐药性方 面的信息 指导抗病毒治疗 43 二 流行性感冒病毒 流行性感冒病毒 Influenza virus 是引起 流行性感冒的病原体 分为甲 A 乙 B 和丙 C 3个型别 根据病毒颗粒表面血凝素血凝素 Haemagglutinin HA 和神经氨酸酶神经氨酸酶 Neuramiridase NA 的抗原性 甲型流感病毒又可分为不同的亚 型 甲型流感病毒易发生变异 致病力强 1918 年发生在西方国家的大流感
15、杀死了几千万人 即是由甲型流感病毒引起 There are 16 different H antigens H1 to H16 and nine different N antigens N1 to N9 44 45 一 流感病毒基因组结构 单链RNA病毒 RNA为负链 有8个RNA片段或7个RNA片段 所有RNA片段5 末端和3 末端高度保守 两种不同亚型病毒感染宿主时 会生成基因 重配的新病毒 RNA基因在复制过程中 常会发生点突变 46 二 分子诊断方法 可采用RT PCR FQ PCR检测流感病毒 RNA 引物常按流感病毒保守的非结构基因 NS 的序列进行设计 为证实PCR扩增产物的特
16、异性或提高检测的 灵敏度 可用限制性内切酶分析法 斑点杂 交法 Southern印迹法进行扩增产物的分析 47 扩增位置 引物序列 扩增片段大 小 NS基因 5 AAGGGCTTTCACCGAAGAGG 3 190 bp 5 CCCATTCTCATTACTGCTTC 3 NS基因 5 ATGGCCATCGGATCCTCAAC 3 241 bp 5 TGTCAGCTATTATGGAGCTG 3 48 三 临床意义 流感病毒的诊断过去主要靠鸡胚羊膜腔培 养和血清学血凝抑制试验 这些方法比较费 时 灵敏度低 难以作出早期诊断 PCR法敏感 特异 简便 快速 并且可 用于流感病毒的分型和流行病学调查 49 三三 人类免疫缺陷病毒 人类免疫缺陷病毒 HIV HIV HIV human immunodeficiency virus AIDS acquired immunodeficiency syndrome HIV为艾滋病的病原体 现已发现引起艾滋病 的病毒有HIV 1 HIV 2 HIV 3三种 1998年底艾滋病感染者和艾滋病患者总数为 3 340万 已死亡1 390万 是全球十大主要 死因
