《补体检测及应用PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《补体检测及应用PPT课件.ppt（32页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第十九章 补体检测及应用 1 存在于人和脊椎动物血清或组织液 具有酶样活 性 不耐热的糖蛋白 由肝细胞 巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种 细胞产生均为多糖蛋白 可以辅助抗体发挥溶细胞作用 补体不是单一成分 以 补体系统 存在 在正常人血清中含量相对稳定 某些疾病时 含 量及其活性可发生改变 因此对补体含量与活性 进行检测 对相关疾病进行诊断 补体 complement C 2 第一节 概 述 一 补体成分的含量与理化特性 1 根据补体系统的生物学功能分类 补体固有成分 补体调节蛋白 补体受体 complement receptor CR 3 补体 成分 分子量 电 泳 区 带 血清含量参 考值
2、 g ml 补体 成分 分子 量 电 泳 区 带 血清含量参 考值 g ml C1q390 270C979 240 C1r95 35B95 210 240 C1s85 35D25 2 C2117 120 30P220 225 C3190 11300C1INH150 180 C4180 2430 600C4bp1100250 C5190 275I因子93 50 C6128 260H因子159 400 480 C7120 255S因子88 500 C8163 1200 4 对热不稳定 56 30min即被灭活 0 10 条件下活性只能保持3 4d 多种理化因素如射线 机械振荡 酒精 胆汁和某些添加
3、剂等均可破坏补体 2 补体的理化特性 5 二 补体的活化途径 P因子6 7 经典激活途径 旁路激活途径MBL途径 激活物质抗原抗体复合物 微生物表面膜性结 构 肽聚糖 酵母 多糖 脂多糖等 MBL C反应蛋白 起始分子C1qC3C2 C4 参与补体成分 C1 C4 C2 C3 C5 C9 C3 C5 C9 B因子 D因子 C2 C9 MASP 所需离子Ca2 Mg2 Mg2 Ca2 C3转化酶C4b2bC3bBbC4b2b C5转化酶C4b2b3bC3bnBbC4b2b3b 生物学作用 参与特异性免 疫的效应段 感 染后期发挥作用 参与非特异性免疫 的效应阶段 感染早 期发挥作用 参与非特异性
4、免 疫的效应阶段 感 染早期发挥作用 8 第二节 补体总活性测定 补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指 示 以50 溶血为判断终点 称为 CH50 50 complement hemolysis 应用不同的激活物可活化不同的补体途径 基于经典途径的CP CH50 临床常规项目 应用于C3旁路检测的AP CH50 尚未列入 检验常规 9 1 CH50测定法的原理 10 在适当 稳定的反应 系统中 溶 血反应与补 体的剂量依 赖关系呈现 S 形曲线 补体的剂量 以引起50 溶血所需要的最小补体量为一个 CH50U 可计算出待测血清中总的补体溶血活性 以CH50U ml表示 11 2 2 CH50
5、CH50测定方法 以测定方法 以2 52 5ml反应体系为例 2 绵羊 红细胞 1 20稀释 待检血清 稀释缓 冲液 磷酸 或巴比妥 2U溶 血素 1 1 1 50ml 0 5ml 0 5ml 0 10 0 15 0 20 0 50 0 00 1 40 1 35 1 30 1 00 1 50 37 水浴箱中温育30min后2000r min离心10min 致敏红细胞 12 2 试验结果判断 50 溶 血 标 准 管 肉眼观察溶血程度肉眼观察溶血程度 与之最相近的两管与之最相近的两管 置于分光光度计置于分光光度计 读读 取取 ODOD542 542 值值 最接近标准管最接近标准管 ODOD值的一
6、管值的一管 确定为补体最高反应管确定为补体最高反应管 3 50 溶血的总补体值的计算 CH50 U ml 1 1 待检血清用量待检血清用量 稀释倍数稀释倍数 注意 用CH50法测定总补体溶血活性时 所测的值与反 应体积成反比例关系 一般以反应总体积2 5ml为常用 测得的总补体活性的参考范围为50 100U ml 13 举举 例例 血清补体总活性测定 试管号 1 20稀 释待检血 清 巴比妥 缓冲液 2U溶血素2 SRBC眼观结果OD541 10 101 400 500 50不溶血 20 151 350 500 50不溶血 30 201 300 500 50部分溶血1 5678 40 251
7、250 500 50大部分溶血1 6789 50 301 200 500 50全溶血 0 500 50全溶血 90 501 000 500 50全溶血 100 001 500 500 50不溶血 50 溶血标准管的OD542 1 6610 第4管为最高有效反应管 CH50 U ml 1 1 0 250 25 2020 80 80 表明 待测血清50 溶血的总补体值为80 在2 5 ml 反应体系的总补体活性的参考范围50 100U ml内 14 3 方法评价与临床意义 方法简便 快速 但敏感性低 补体的活性除 与反应体积成反比外 还与反应所用的缓冲液 SRBC的数量以及反应温度都有关 CH50
8、增高见于 心肌梗死 甲状腺炎 大叶性肺炎 糖尿病 妊娠等 CH50降低见于 严重肝病或不良时营养 细菌感染 自身免疫病的诊断及动态检测 15 第二节 补体组分的检测 常作为单个补体成分的检测指标 C3 C4 C1q B因子和C1酯酶抑制物等 测定方法 活性测定 免疫溶血法 含量测定 免疫化学法 自动化免疫散射比浊 法 16 免疫溶血法 定义 是根据补体参与介导抗体溶细胞作用的级联 效应特征建立的单一补体成分检测法 指示系统 以SRBC 抗SRBC为激活物和指示系统 参照体系 以人为设计的缺乏某种补体成分的血清 为参照 结果判度 若有溶血发生 表明待检标本存在参照 血清所缺乏的补体成分 且溶血程
9、度与此补体成分 的量呈正比 仍以50 溶血为终点 17 免疫溶血法试验原理免疫溶血法试验原理 溶血反应 指示系统 实验参照系 统的补体 待测血清中的补体 选用先天缺乏待测补体成分的动物或人的血清 通过利用化学试剂人为灭活正常血清中待测补体 成分从而来制备缺乏该补体成分的补体试剂 与CH50试验中的SRBC和溶血素一样 在有 完整补体系统存在时 SRBC发生溶解 结果结果 表明待测血清中含有待测的补体成分 表明待测血清中含有待测的补体成分 其活性则由溶血程度来衡量其活性则由溶血程度来衡量 表明待测血清中也不含有有待测的补体表明待测血清中也不含有有待测的补体 成分成分 溶血及溶溶血及溶 血程度血程
10、度 不溶血不溶血 R试剂 18 参照血清常称之 R remove 试 剂 即去除某种补体成分之意 已能筛选 到的血清有人C2缺乏 豚鼠C4缺乏 小 鼠C5缺乏和家兔C6缺乏的血清 免疫溶血法常用于C2 C3 C4 C5 C6等补体成分的检测 其中以C3 C4 两成分的检测更为常见 19 第三节 补体结合试验 补体结合试验 complement fixation test CFT 是指在补体的参与下 以绵羊红细胞 SRBC 和溶血素 抗SRBC的抗体 作为指示系统的用已知抗原或抗体检测相 应未知抗体或抗原 20 一 试验原理 包括两个系统五种成分 v待检系统 已知Ag或Ab 待检Ab或Ag 及仅
11、供一组Ag Ab系统反应的定量补体 v指示系统 绵羊红细胞和溶血素 21 Ag 待测血清 Ab 阳性 No Ab 阴性 Ag Ag Ag 22 二 方法 12345 试验试验 管管 血清血清 对照管对照管 抗原抗原 对照管对照管 补体补体 对照管对照管 SRBCSRBC 对照管对照管 待测血清待测血清0 2m0 2m L L 0 2m0 2m L L 0 2m0 2m L L 0 2m0 2m L L 0 2m0 2m L L 0 2m0 2m L L 0 2m0 2m L L 0 2m0 2m L L 0 2m0 2m L L 0 2mL0 2mL0 4m0 4m L L 0 8mL0 8m
12、L 抗原抗原 补体补体 N N S S 摇匀 摇匀 37 37 水浴 水浴15min15min 溶血素溶血素 SRBSRB C C 0 2m L 0 2m L 0 2m L 0 2m L 0 2m L 0 2m L 0 2m L 0 2m L 0 2m L 摇匀 37 水浴15min 23 预期结果 管内液体混浊呈浅红色为不溶血 管内液体透 明呈红色为溶血 溶血不溶血 2 试验管 血清对照 管 抗原对照 管 补体对照 管 SRBC对照 管 溶血溶血溶血不溶血 24 1 补体的滴定滴定 管号1 60补体缓冲液溶血素 放 置 37 水水 浴浴 3030 minmin 致敏SRBC 放 置 37 水
13、水 浴浴 3030 mimi n n 结果 10 040 260 100 20不溶血 20 060 240 100 20不溶血 30 080 220 100 20微溶血 40 100 200 100 20微溶血 50 120 180 100 20全溶血 60 140 160 100 20全溶血 1个实用单位 能产生完全溶血的最小补体量 正式试验中使用2个实用单位 三 技术要点 25 2 已知抗原或抗体的滴定 通过CFT试验 抗原 抗体 对照 1 41 81 161 321 641 1281 2561 512 1 4444444320 1 8444443210 1 16444433200 1 3
14、2444432100 1 64444421000 1 128421000000 1 256310000000 1 512000000000 对照000000000 抗原和抗体效价的方阵滴定 1 64的抗原作为一个单位 1 32的抗体作为一个单位 2 4个单位 即1 32 1 16 4个单位 即 1 8 正式试验 26 最好 采集血标本后及时分离血清并尽快检 测 保存 20 检测不同时采集的2份以上 血清 实验前灭活补体和某些非特异性反应因素 加热56 30min或60 3min 3 待测标本 27 四 方法评价 优 点 灵敏度高 所测定的抗体水平可达0 05 g ml 出现交叉反应的机率较小
15、可检测的抗原或抗体范围广泛 无需特殊设备 结果容易观察 试验条件要求不高 现 状 影响的因素多 各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等 现代化 自动化抗原抗体检测方法的不断涌现 补体结 合试验逐渐被遗弃 补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型 其设计和原 理仍对新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用 28 复习题 1 已知补体的活化有三条途径 试述三条激活 途径有何不同 2 补体结合试验的原理和方法 3 血清总补体容血活性 CH50 测定的原理 及方法 4 免疫溶血法测定补体单个成分的原理 29 50 50 溶血标准管溶血标准管 2 2 绵羊红细绵羊红细 胞胞 0 50ml0 50ml 蒸馏水蒸馏水2
16、0ml2 0ml 第一步第二步第三步 1 80 Na1 80 Na ClCl溶液溶液 2 0ml2 0ml 2 2 绵羊红绵羊红 细胞细胞 0 50ml0 50ml 50 SR BC全部 溶解 0 9 等渗溶 液 50 SRBC存 在 50 溶 血 标 准 管 取2 5ml随试 验一起温育 30 溶血素的滴定溶血素的滴定 管 号 溶血素 稀释度 试管内加入的试剂量 ml 37 30min 30min 观察观察结果 溶血素1 60补体缓冲液2 SRBC 11 10000 10 20 20 1全溶血 21 20000 10 20 20 1全溶血 31 30000 10 20 20 1全溶血 41 40000 10 20 20 1全溶血 51 50000 10 20 20 1大部分溶血 61 60000 10 20 20 1微溶血 71 70000 10 20 20 1不溶血 一个溶血素单位 一个溶血素单位 UU 如表中的 如表中的1 40001 4000 在试验中一般使用2U 即1 20001 2000 31 32
