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1、考点一基因工程的操作工具1限制性核酸内切酶(简称限制酶)(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(3)结果：产生黏性末端或平末端。2DNA连接酶种类Ecoli DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只缝合黏性末端缝合黏性末端和末端作用恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键3载体(1)作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。(2)种类：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。(3)条件基础自测1判断下列叙述的正误(1)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列()(
2、2)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因()(3)限制酶只能用于切割目的基因()(4)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来()(5)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶()(6)Ecoli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端()(7)用于载体的质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点()(8)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达()2载体需具备的条件及其作用(连线)3据两种限制酶的作用图示填空(1)已知限制酶EcoR和Sma识别的碱基序列和酶切位点分别为GAATTC和CCCGGG，在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末
3、端。(2)写出产生的末端的种类：产生的是黏性末端；产生的是平末端。(3)EcoR限制酶和Sma限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性。4学透教材、理清原因、规范答题用语专练(1)是_酶，是_酶，二者的作用部位都是_。(2)限制酶不切割自身DNA的原因：_。答案：(1)限制DNA连接磷酸二酯键(2)自身DNA不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰1.与DNA有关的酶的比较名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶磷酸二酯键
4、脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端2限制酶的特点与使用(1)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(2)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与
5、载体也可以连接起来。(3)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。对点落实1(2016全国卷)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR 、BamH 和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。GAATTCGGATCCGATCCTTAAGCCTAGGCTAG图(a)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_。(2
6、)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。图(b)图(c)(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。解析：(1)由题图可知，BamH和Sau3A两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamH酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3A酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能顺利地转录，再
7、完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有Ecoli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。答案：(1)Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案也可)(3)Ecoli DNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶(其他合理答案也可)2(2016江苏高考，有改动)下表是几种限制酶识别序列及其切割
8、位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：限制酶BamHBclSau3AHind识别序列及切割位点(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过_酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于_态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_。(3)若BamH酶切的DNA末端与Bcl酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为_，对于该部位，这两种酶_(填“都能”“都不能”或“只有一种能”
9、)切开。(4)若用Sau3A切图1质粒最多可能获得_种大小不同的DNA片段。解析：(1)基因工程中选择合适的限制酶切割质粒和目的基因时，应保留目的基因和至少一个标记基因结构的完整性，即遵循“目的基因切两侧，标记基因留一个”的基本原则，最好选择切割产生不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入带来的不正常表达，因此据图分析应选择的限制酶为Bcl和Hind，切割后质粒上保留的四环素抗性基因作为标记基因。酶切后的载体和目的基因通过DNA连接酶的作用形成重组质粒，重组质粒需要导入Ca2处理后的处于感受态的大肠杆菌(处于感受态的大肠杆菌细胞膜的通透性大大增加，便于重组质粒进入)
10、。(2)由上述分析可知，为了筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，应先配制含四环素的选择培养基，平板上长出的菌落为导入普通质粒或重组质粒的大肠杆菌菌落，进一步鉴定出导入重组质粒的大肠杆菌，可利用PCR扩增的方式，结合电泳技术来分析处理。DNA的两条链是反向平行的，在PCR过程中，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶只能从引物的3端延伸DNA链，因此应选择引物甲和引物丙。(3)因为Bcl和BamH酶切产生的黏性末端相同，所以可以被DNA连接酶连接，连接部位的6个碱基对序列为，但是连接后形成的DNA中不再具有Bcl和BamH的识别序列，连接部位不能被这两种酶切开。(4)由图可知，能被限制
11、酶Bcl和BamH切割的序列也能被Sau3A识别并切割，因此图中质粒上存在3个Sau3A的切割位点，若将3个切割位点之间的DNA片段分别编号为a、b和c，则完全酶切(3个切割位点均被切割)会产生3种大小的DNA片段，即为a、b和c；考虑只切1个切割位点，有3种情况，都产生1种大小的DNA片段，即大小均为abc；考虑切2个切割位点，则会产生ab、c、ac、b、bc、a几种不同大小的DNA片段。综上所述，若用Sau3A识别并切割图中质粒，最多可获得7种大小的DNA片段，即为abc、ab、ac、bc、a、b、c。答案：(1)Bcl和Hind连接感受(2)四环素引物甲和引物丙(3)都不能(4)7类题通
12、法选择限制酶的技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因。考点二基因工程的基本操作程序基因工程的基本操
13、作程序1目的基因的获取(1)目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。(2)获取方法2基因表达载体的构建(1)构建基因表达载体的目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子及标记基因等。3目的基因导入受体细胞受体细胞类型方法植物细胞农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法动物细胞显微注射技术(注射到受精卵内)微生物细胞感受态细胞法(Ca2处理法)4目的基因的检测与鉴定检测目的检测方法判断标准目的基因是否插入转基因生物的DNADNA分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否翻译出蛋白
